MMP-9及HIF-1α在鼻NK/T细胞淋巴瘤表达中的作用研究

韦花媚　刘坤平　罗春英　卢运龙　黄永秩　苏群英　陆海善

(暨南大学附属清远人民医院病理科，清远511500)

MMP-9及HIF-1α在鼻NK/T细胞淋巴瘤表达中的作用研究

韦花媚①刘坤平罗春英①卢运龙①黄永秩①苏群英①陆海善①

(暨南大学附属清远人民医院病理科，清远511500)

[摘要]目的：研究鼻NK/T细胞淋巴瘤组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧诱导因子-1ɑ(HIF-1ɑ)的表达情况及其与患者临床病理特征的关系。方法：选取右江民族医学院附属医院经病理检查确诊为鼻NK/T细胞淋巴瘤患者，收集病理组织蜡块标本46例(病例组)、同期内镜检查取鼻甲黏膜组织经病理学证实为黏膜慢性炎症标本20例(对照组)，分别采用HE染色法和免疫组织化学法处理两组标本，观察两组标本的病理形态、MMP-9及HIF-1ɑ的表达差异，并分析其与患者临床病理特征的关系。结果：病例组的HIF-1α表达阳性率67.39%(31/46)、对照组表达阳性率为6.52%(3/20)，病例组的HIF-1ɑ表达显著的高于对照组(P<0.05)。病例组的MMP-9表达阳性率71.74%(33/46)、对照组表达阳性率为6.52%(3/20)，病例组的MMP-9表达显著的高于对照组(P<0.05)。HIF-1ɑ、MMP-9在阳性表达在Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、发生淋巴结转移、血管浸润鼻NK/T细胞淋巴瘤患者的患者组织中出现高表达(P<0.05)。结论：鼻NK/T细胞淋巴瘤患者组织中HIF-1α、MMP-9呈现高表达，并且与患者发生Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、发生淋巴结转移、血管浸润具有一定的关系。

[关键词]鼻NK/T细胞淋巴瘤；基质金属蛋白酶-9；缺氧诱导因子-1α；临床病理特征

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤是恶性淋巴瘤分类中较为独立的一种，曾称为中线特殊类型外周T淋巴瘤、中线致死性肉芽肿，其细胞类型来源主要来自于外周成熟的NK细胞，少部分来源于NK样T细胞，故称为NK/T细胞淋巴瘤。临床上主要累及部分为鼻腔，病理类型改变多为鼻腔以及面中线损毁性病变，伴有血管的破坏和灶性坏死[1,2]。对于其相关病因的探讨认为EB病毒的参与可能较为显著地促进了NK/T细胞淋巴瘤的发生发展，而部分学者认为基质金属蛋白酶-9(MMP-9)以及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)可能在此过程中发挥了血管侵袭、细胞外基质破坏以及缺氧性应答等作用[3,4]，但对于其在NK/T细胞淋巴瘤中的表达以及其与相关临床特征关系之间的研究较少，本次研究重在分析鼻NK/T细胞淋巴瘤组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达情况及其与患者临床病理特征的关系。

1资料与方法

1.1一般资料选取右江民族医学院附属医院收集的经病理检查确诊为鼻NK/T细胞淋巴瘤的患者的病理组织蜡块标本46例(病例组)、同期内镜检查取鼻甲黏膜组织经病理学证实为黏膜慢性炎症标本20例(对照组)。所有纳入对象均经临床病理检查确诊；研究对象的临床资料完整，可进行本次研究相关分析。病例组46例患者，年龄19～72岁，平均年龄(49.2±11.5)岁；其中男29例、女17例；病变部位分别位于：鼻腔34例、鼻咽部4例、硬腭3例、软腭2例、扁桃体3例；根据Ann Arbor分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期14例、Ⅲ期16例、Ⅳ期8例；出现颈部淋巴结转移17例，血管浸润24例。对照组20例患者，年龄22～58岁，平均年龄(46.1±10.7)岁，其中男12例、女8例。两组患者的年龄、性别构成差异不具有统计学意义(P<0.05)。

1.2方法

1.2.1HE染色方法石蜡切片放置于二甲苯溶液中10 min，采用乙醇水化，苏木紫染色5 min，1%盐酸酒精分化20 s，0.1%胺水溶液返蓝30 s，伊红溶液浸染3～5 min，之间采用流水常规冲洗30 s，之后采用中性树胶封片。

1.2.2免疫组织化学法标本放置于90℃烤箱中烘烤25 min，二甲苯溶液浸泡两次，每次5 min，采用不同浓度的乙醇水化后PBS洗涤3次，每次5 min，过氧化氢溶液室温孵育10 min，柠檬酸缓冲盐进行热抗原修复，之后分别加入一抗和二抗(抗体均采用PBS缓冲液1∶100稀释配置，一抗以及二抗均购自南京凯基生物科技有限公司)。DAB显色后，采用苏木素复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察。

1.2.3免疫组化法结果判定标准MMP-9及HIF-1α免疫组化阳性表达均为胞浆或胞核中出现棕黄色颗粒，HIF-1α以胞核及胞核部分胞质呈淡黄色或棕黄色颗粒为阳性，MMP-9以胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。免疫组织化学法的结果判定标准，按照着色强度进行分级，0分：无色；淡黄色：1分；棕黄色：2分，褐色：3分；显微镜下染色阳性细胞计数：未见黄色颗粒细胞为0分；<10%：1分；10%～50%：2分；51%～80%：3分；>80%:4分；两个得分项目相加为最终评分，(-)为总分1～2分，阴性表达；(+)为3分，弱阳性表达；(++)为4～5分，中阳性表达；(+++)为6～7分，强阳性表达。

2结果

2.1两组患者的组织标本中HIF-1α及MMP-9 表达情况比较病例组的HIF-1α表达阳性率67.39%(31/46)、对照组表达阳性率为6.52%(3/20)，病例组的HIF-1α表达显著高于对照组(P<0.05)，见表1，HE染色见图1A，免疫组化染色见图2A。

表1两组患者的组织标本中HIF-1ɑ表达比较

Tab.1Comparison of HIF-1α expression in tissues of two groups of patients

Groupsn-++++++ZPCasegroup461571212-4.142<0.001Controlgroup2017300

图1　HE染色(HE，×100)Fig.1　Result of HE staining(HE，×100)Note: A.Control group;B.Case group.

图2　免疫组化(SP，×400)Fig.2　Expression of Immunohistochemical(SP，×400)Note: A.HIF-1α;B.MMP-9.

表2两组患者组织标本中MMP-9的表达比较

Tab.2Comparison of MMP-9 expression in tissues of two group of patients

Groupsn-++++++ZPCasegroup461381312-4.42<0.001Controlgroup2017300

表3组织标本中HIF-1α表达与患者的临床病理特征关系

Tab.3Relationship between HIF-1α expression and clinicopathological characteristics of patients

ProjectPositiveNegativeThepositiverate(%)χ2PSex0.9010.343Male21872.41%Female10758.82%Age(years)0.110.741<6017965.38%≥6014670.00%Lactatedehydrogenase1.3220.25Normal13959.09%Increase18675.00%AnnArborStage9.2340.002Ⅰ-ⅡStage101245.45%Ⅲ-ⅣStage21387.50%Cervicallymphnodemetastasis5.3310.021Yes15288.24%No161355.17%Vascularinvasion5.8040.016Yes20483.33%No111150.00%

表4组织标本中MMP-9表达与患者的临床病理特征关系

Tab.4Relationship between MMP-9 expression and clinicopathological charocteristics of patients

ProjectPositiveNegativeThepositiverate(%)χ2PSex0.6580.417Male22775.86%Female11664.71%Age(years)0.1860.667<6018869.23%≥6015575.00%Lactatedehydrogenase1.3660.243Normal14863.64%Increase19579.17%AnnArborStage9.8290.002Ⅰ-ⅡStage111150.00%Ⅲ-ⅣStage22291.67%Cervicallymphnodemetastasis6.6610.01Yes16194.12%No171258.62%Vascularinvasion9.8290.002Yes22291.67%No111150.00%

病例组的MMP-9表达阳性率71.74%(33/46)、对照组表达阳性率为6.52%(3/20)，病例组的MMP-9表达显著高于对照组(P<0.05)，见表2，HE染色见图1B，免疫组化染色见图2B。

2.2鼻NK/T细胞淋巴瘤患者的组织标本中HIF-1ɑ及MMP-9 表达与患者临床病理特征的关系HIF-1ɑ、MMP-9在阳性表达在Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、发生淋巴结转移、血管浸润鼻NK/T细胞淋巴瘤患者的患者组织中出现高表达(P<0.05)，见表3、4。

3讨论

近年来对于NK/T细胞淋巴瘤的相关病因学探讨分析认为，EB病毒的感染是导致其发生发展的主要原因，相关研究分析认为90%的NK/T细胞淋巴瘤由于后天性感染EB病毒而致病，相关临床治疗可以发现NK/T细胞淋巴瘤的治疗面临着类似其他恶性肿瘤的治疗难题，其耐药以及较为严重的血管侵袭性改变显著影响了患者的临床预后[5]。在EB病毒感染导致的致病过程中，细胞外基质通过其与相关整合素受体的结合，从而直接释放或者诱导宿主分泌MMP-9，作为基质金属家族中分子量最大的酶，可以通过破坏和降低细胞外基质中的胶原和明胶，促进肿瘤细胞转移。相关研究也证实，分化较差或者侵袭性较为明显的肿瘤细胞其细胞膜表面的MMP-9表达明显升高[6]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)被认为在肿瘤缺氧应答中处于较为关键的位置，与肿瘤细胞血管的生成密切相关[7]，通过调节体内相关缺氧性细胞因子的释放，进而调控肿瘤新生血管的生成，相关临床研究也发现，通过抑制缺氧诱导因子-1ɑ(HIF-1ɑ)可能作为肿瘤治疗的有效途径[8，9]，但对于二者在NK/T细胞淋巴瘤中的表达，特别是其与相关临床病理特征的关系研究较少。

MMP-9通过讲解细胞外Ⅳ型以及Ⅴ型胶原纤维，进而参与肿瘤的发生发展过程，笔者通过分析发现，病例组的MMP-9表达阳性率达71.74%，显著高于鼻甲黏膜慢性炎症组织的表达水平，提示了MMP-9参与到了NK/T细胞淋巴瘤的发生发展过程。而相关研究也证实，MMP-9除了可以通过降解细胞外基质参与肿瘤的发生发展，MMP-9同样参与到了增强上皮细胞运动能力、参与肿瘤的侵袭、转移以及血管生成中。笔者通过研究MMP-9与相关临床病理特征之间的关系后发现，随着临床分期的增加以及肿瘤发生血管侵袭或者淋巴结转移，组织中MMP-9的表达显著升高，进一步提示了MMP-9在NK/T细胞淋巴瘤发生发展中的作用[10]。部分学者发现，随着Ann Arbor分期的增加，MMP-9呈现出了较为明显的增加趋势，但Ⅲ期或者Ⅳ期患者差异并不明显[11]，而Ye和Souza等[12]学发现，发生血管侵袭性转移以及远处淋巴结转移的病例的MMP-9升高可达对照组的4～5倍，而相关机制研究表明EB病毒感染导致的癌蛋白LMP-1的激活可以促进AP-1信号通路的激活[13]，进而促进MMP-9对于血管基底膜以及细胞外胶原纤维的作用[14]。而对于HIF-1α的研究表现出了较为相似的结论，提示了HIF-1α参与到了NK/T细胞淋巴瘤的发生发展过程。笔者通过分析近年来国外相关文献后发现，NF-κB可以通过旁分泌途径促进MMP-9以及HIF-1α的表达，进而促进其对于肿瘤的转移、淋巴侵袭等作用。同时部分学者认为，肿瘤坏死因子α(TNF-α)在HIF-1α生成过程中的抑制性调节可能促进了NK/T细胞淋巴瘤的免疫逃逸以及促新生血管的生成[15]。

综上所述，鼻NK/T细胞淋巴瘤患者组织中HIF-1ɑ、MMP-9呈现高表达，并且与患者发生Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、发生淋巴结转移、血管浸润具有一定的关系，但相关信号通路的传递以及表达的调节机制有待于进一步研究探讨。

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[收稿2015-07-09]

(编辑许四平)

Study on effect of MMP-9 and HIF-1α expression in nasal NK/T cell lymphoma

WEI Hua-Mei,LIU Kun-Ping,LUO Chun-Ying，LU Yun-Long,HUANG Yong-Yi,SU Qun-Ying,LU Hai-Shan.

Department of Pathology,Qingyuan Hospital School of Medicine,Ji′nan University,Qingyuan 511500,China

[Abstract]Objective:To study the expression of MMP-9 in nasal NK/T cell lymphoma, HIF-1ɑ and its relationship with the clinical and pathologic characteristics.Methods: 46 cases (case group) of paraffin block specimens from patients with pathologically confirmed nasal NK/T cell lymphoma were collected from the Affiliated Hospital of Youjiang Medical College For Nationalities,the same period endoscopy turbinate mucosa were confirmed by pathology in 20 cases of chronic inflammation of mucosa specimens (control group), respectively HE staining and immunohistochemistry handle two specimens, observation of the expression differences of two groups of specimens of pathological morphology, MMP-9 and HIF-1ɑ, and to analyze its relationship with the clinical and pathological features of the patients.Results: Case group HIF-1ɑ expression rate 67.39% (31/46), expression was 6.52% (3/20) in control group., the HIF-1ɑ case group were significantly higher than control group (P<0.05).Case group MMP-9 expression rate 71.74% (33/46), in the control group expression was 6.52% (3/20), MMP-9 expression in the case group was significantly higher than control group (P<0.05).HIF-1ɑ and MMP-9 in positive expression in Ann Arbor staging (Ⅲ-Ⅳ), lymph node metastasis, vascular invasion in patients with nasal NK/T cell lymphoma tissue appeared a high expression (P< 0.05).Conclusion: Nasal NK/T cell lymphoma tissue of patients with HIF-1ɑ, MMP-9 presented high expression, and there was a certain relationship between Arbor Ann stage (Ⅲ-Ⅳ), lymph node metastasis and vascular invasion.

[Key words]Nasal NK/T cell lymphoma;Matrix metal loproteinase-9;Hypoxia inducible factor alpha-1;Clinical pathological characteristics

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.020

作者简介：韦花媚(1983年-)，女，在读硕士，住院医师，主要从事诊断病理学方面的研究。

通讯作者及指导教师：刘坤平(1963年-)，女，博士， 主任医师，主要从事肿瘤病理诊断及研究工作。

中图分类号R392

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0863-04

①右江民族医学院附属医院病理科，百色533500。