喹啉双季铵盐与小牛胸腺DNA的作用研究

田　瑜，刘汉明，陈　静，金义杰，夏彩芬*

(1.湖北工程学院 化学与材料科学学院，湖北 孝感 432000;2.湖北省孝昌县第一中学，湖北 孝昌 432900)

喹啉双季铵盐与小牛胸腺DNA的作用研究

田瑜1，刘汉明2，陈静1，金义杰1，夏彩芬1*

(1.湖北工程学院 化学与材料科学学院，湖北 孝感 432000;2.湖北省孝昌县第一中学，湖北 孝昌 432900)

摘要：采用紫外吸收光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法、等温滴定微量热法研究了喹啉双季铵盐(BZQN)与小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用机理及热力学关系。研究结果表明：BZQN具有显著的荧光，在DNA的作用下，BZQN的荧光发生明显的猝灭，并且猝灭常数(Ksv)随着温度的升高而增大，符合动态猝灭的特征；紫外可见光谱实验、热变性实验及圆二色谱结果均表明，BZQN与DNA主要发生嵌插结合，从而导致DNA的二级结构发生改变；等温滴定量热实验表明BZQN与DNA的结合位点数约为4，推测BZQN与DNA的结合是熵驱动过程。

关键词：喹啉双季铵盐；小牛胸腺DNA；光谱法；等温滴定微量热

喹啉类化合物是一类在医药等领域有着广泛应用的芳香杂环化合物，有关此类化合物的合成及应用近年来受到人们的广泛关注[1-3]。喹啉是杂环芳香性有机化合物，分子式是C9H7N，微溶于水，易发生取代反应，因此可以在喹啉环的基础上通过修饰母体结构改善水溶性，连接不同的取代基实现其不同的生物功能。基于此，本文通过喹啉环上的苄溴取代反应合成喹啉双季铵盐(BZQN)，并采用紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法、等温滴定量热等方法探讨了其与DNA相互作用的机理及热力学关系，喹啉双季铵盐其结构如图1所示。

图1　喹啉双季铵盐其结构

1材料与方法

1.1实验仪器与试剂

1.1.1实验仪器

本实验所用主要实验仪器如表1所示。

1.1.2实验试剂

本实验所用主要实验试剂如表2所示。

1.2实验内容

1.2.1紫外光谱实验

小牛胸腺 DNA(Sigma公司)用 PBS稀释，查文献[4]可知，0.01 g/L ctDNA的浓度在吸收光谱260 nm 处的摩尔吸收系数 ε260=6 600 L/(mol.cm)，从而确定本实验中配制的ctDNA的摩尔浓度为2.2×10-5mol/L。

取2 mL 2.2×10-5mol/L ctDNA溶液于比色皿中，相应的试剂PBS作为参比，测试BZQN的系列浓度作用下，各溶液的紫外可见吸收光谱，重复3次。

在35 ℃时，测试2 mL 2.44×10-5mol /L ctDNA溶液紫外吸收强度。将恒温槽程序升温至95 ℃ (在35～95 ℃之间，每隔5 ℃记录测试溶液的紫外吸收强度)，然后在2 mL 2.44×10-5mol/L ctDNA溶液中加入2 μL 5.63×10-4mol/L BZQN溶液混合均匀，重复上述过程，得BZQN作用前后ctDNA的热变性曲线。

表1　实验仪器

表2　实验试剂

1.2.2荧光光谱实验

取2 mL 2.25×10-5mol/L BZQN溶液于比色皿中，测试溶液的荧光强度作为空白对照，分别加入不同浓度的ctDNA溶液，测试溶液的稳态荧光强度，得ctDNA滴定BZQN的稳态荧光光谱；然后取2 mL 8.35×10-5mol/L DNA溶液于比色皿中，测试溶液的荧光强度作为空白对照，分别加入不同浓度的BZQN溶液，通过反滴定实验，得BZQN滴定ctDNA的稳态荧光光谱。

设置BZQN激发波长为340 nm，记录400～650 nm之间发射光谱，获取BZQN和BZQN-ctDNA体系的三维荧光光谱。分别控制温度为25 ℃、31 ℃和37 ℃，取2 mL 2.25×10-5mol/L的BZQN溶液于比色皿中，加入系列浓度的ctDNA，测试各溶液的荧光强度，重复3次。

取40 μL 5.42×10-3mol/L的ctDNA溶液和10 μL 5.63×10-4mol/L的BZQN溶液分别用pH=8、9、10、11、12和13的Britton-Robison缓冲溶液配成2 mL的溶液，在最佳激发波长(340 nm)和最佳发射波长(490 nm)下测定不同pH值条件下的荧光强度，得ctDNA碱变性曲线图。

1.2.3圆二色谱实验

DNA 是光学活性物质，因此可通过测定圆二色谱(CD)了解其构象变化。实验所用仪器为Chirascan圆二色谱仪，光源系统用氮气保护(流量为5 L/min)，样品池的光径为0.5 mm，扫描波段为 200～320 nm，DNA的浓度为 0.3 g/L。实验时在样品池中放置90 μL的 DNA溶液，加入9 μL 1.13×10-3mol/L BZQN溶液，测量DNA和DNA-BZQN溶液的CD谱。

1.2.4等温滴定微量热实验

BZQN与DNA作用的热力学焓变由Nano ITC3G采用连续注射的方法完成，用仪器自带的Nano ITC Analyze 软件进行数据采集和处理。将250 μL 1.13×10-4mol/L的BZQN溶液装入250 μL 滴定针，设定总的滴定次数为25次，每次滴 10 μL于1.00 mL 2.17×10-5mol/LDNA溶液中；连续滴定时间间隔为300 s，每次滴定持续时间为2 s。2次滴定实验的时间间隔大约45 min，使信号有足够的时间返回基线。测量池的温度控制为25 ℃，安瓿瓶中搅拌器的转速固定在350 r/min，等基线稳定后再启动实验，以便使因搅拌而产生的热量被自动扣除。为扣除BZQN和DNA的稀释热，要进行空白实验。

2分析与讨论

2.1紫外光谱实验

2.1.1BZQN对ctDNA的紫外吸收光谱的影响

图2是不同浓度的BZQN在ctDNA溶液中的紫外吸收光谱，其中曲线F是2.75×10-2mmol/L BZQN对应的结果。溶液在210 nm、255 nm和325 nm处发生吸收，紫外吸收光谱发生增色效应，溶液的紫外吸收强度随BZQN浓度的增大而增强，说明BZQN与ctDNA之间发生了较强的相互作用。增色、减色效应是DNA所特有的，与其双螺旋结构密切相关的光谱性质，由显著的增色效应可以推测可能是BZQN嵌入到ctDNA的碱基对中，改变了构成碱基堆积力的疏水作用力和范德华力，使DNA的构象和结构的稳定性产生改变[5]，因此推断BZQN与ctDNA之间可能发生了嵌插作用。

2.1.2热变性实验

图3　ctDNA与BZQN-ctDNA的热变性曲线

图3是温度对DNA及BZQN-DNA溶液的吸光度的影响曲线。曲线a是ctDNA，曲线b是BZQN-DNA，由图3可以看出游离ctDNA的Tm约为87 ℃，而BZQN-DNA复合物的Tm约为92 ℃，Tm明显升高。由于嵌插结合会使Tm增加，而沟槽或静电结合对Tm影响很小，因此推测BZQN部分嵌入ctDNA的碱基对中，并在一定程度上增强了ctDNA双螺旋结构的稳定性。

2.2荧光光谱实验

2.2.1稳态荧光

图4是BZQN滴定ctDNA溶液的荧光光谱，其中曲线A是1.67×10-5mol/L ctDNA，BZQN空白对照的浓度为1.88×10-3mmol/L。ctDNA无荧光，当加入BZQN后，溶液的荧光发射峰从470 nm移动388 nm处，且荧光强度随BZQN浓度的增大而增强。说明BZQN对DNA具有增敏作用，且发射波长发生蓝移，表明BZQN与DNA之间发生了强烈的相互作用。

图4　BZQN滴定ctDNA的荧光光谱图

图5　ctDNA滴定BZQN的荧光光谱图

图5是不同浓度的ctDNA在BZQN溶液中的荧光光谱，其中ctDNA空白对照溶液的浓度为1.67×10-2mmol/L。BZQN在470 nm处出现荧光发射峰，溶液的荧光强度随着ctDNA浓度的增大而减小，说明ctDNA对BZQN的荧光有猝灭作用。

2.2.2 三维荧光光谱

三维荧光光谱不仅能够直观地表现核酸分子在不同条件下的构象变化，还可全面展现待测样品的荧光信息，由此使核酸特征构象变化的研究更具有科学性和可靠性[7]。BZQN和BZQN-DNA的三维荧光光谱如图6所示。比较左右两图可以看出：加入ctDNA后，散射峰明显增强，说明BZQN与DNA之间发生了强烈的相互作用；而荧光发射峰的强度减弱，与稳态荧光光谱的结果相同，表明DNA与BZQN发生相互作用后使BZQN的荧光猝灭。

图6　BZQN(左)和BZQN-ctDNA(右)的三维荧光光谱图

2.2.3变温荧光

图7　不同温度下ctDNA对BZQN的

图7是不同温度下的Stem-Volmer曲线。对实验数据进行线性拟合，发现298 K时,Ksv=5.3×104L/mol，303 K时，Ksv=7.9×104L/mol，310K，Ksv=8.8×104L/mol。动态猝灭作用的Ksv值一般都小于2.00×1010L/mol，初步判断DNA对BZQN的猝灭方式可能为动态猝灭。据文献[9]报道，随着温度的升高，会使分子扩散系数增大，分子间发生碰撞的几率增大，发生荧光猝灭的可能性也随之增大。如果荧光猝灭机理是静态猝灭，温度升高会使Ksv减小；若是动态猝灭，则温度的升高会使Ksv增大。同时，升高温度后将降低配合物的稳定性，这就使得形成配合物的可能性也减小[9]。图7中，随着温度升高，Ksv的值明显增大，表明ctDNA对BZQN的猝灭方式为动态猝灭。

2.2.4碱变性实验

ctDNA是具有双螺旋结构的大分子，通过两条链之间的碱基对由氢键相互作用而紧密连接在一起。BZQN是本身具有荧光的物质，与DNA相互作用后形成的BZQN-DNA溶液也具有荧光。DNA的碱变性是指互补碱基间的氢键作用力在碱性溶液中会减弱，导致DNA开链成两条单链而破坏其双螺旋结构[10]。

曲线A-F是pH值为8、9、10、11、12和13时对BZQN-DNA溶液的荧光光谱。由图8可以看出：随着溶液碱性的增强，溶液的荧光强度减弱，且在碱性较强的溶液中荧光强度特别微弱。这种现象可能是因为溶液碱性增强后使DNA的双螺旋结构发生变化，致使BZQN从DNA上脱落，在溶液中游离使能量降低，荧光强度减弱，据此可以推测BZQN应该嵌插于ctDNA的碱基间。

图8　BZQN-DNA体系碱变性曲线图

2.3BZQN对DNA的结构影响

DNA的圆二色谱图(CD)中275 nm波长附近的正峰代表DNA 碱基对的堆积，240 nm 处的负峰是DNA 双螺旋结构的B型构象的特征峰[11]，可以通过正负峰的强度和位置的变化判断DNA结构的变化。

图9 是DNA和BZQN-DNA的CD光谱图。在200～300 nm的紫外区内，ctDNA在275 nm 左右出现一个正的最大值，主要是由于DNA的碱基对堆积而产生的；在240 nm左右出现一个负的最大值，是由DNA的双螺旋结构导致的B型DNA特征峰[11]。加入BZQN溶液后，导致DNA的CD谱发生变化，在275 nm处的CD正峰强度减弱，240 nm处的负峰的强度增强。说明BZQN与DNA之间发生了相互作用，且作用后影响了ctDNA的二级结构的构象，而二级结构的变化会导致DNA三、四级结构的改变，从而引起DNA生物学功能的改变。BZQN加入后，ctDNA的CD谱的谱峰的位置并未发生改变，说明BZQN的加入只影响了DNA的二级构象，并没有使ctDNA分子双螺旋链发生解链[12]。

图9　DNA和DNA-BZQN 溶液的CD谱

2.4BZQN与DNA相互作用的热力学

图10为BZQN与DNA结合的等温滴定微量热(ITC)曲线，以及仪器自带的Nano ITC Analyze 处理软件线性拟合得到BZQN与DNA反应的焓变与熵变，分别为27.72 kJ/mol和200.9 J/(mol·K)，结合常数Ka为4.32×105L/mol，结合位点数n = 4。根据吉布斯-赫姆霍兹公式 (等温状态下)计算可得，常温下BZQN与ctDNA结合的吉布斯自由能变为-32.16 kJ/mol，表明在标准状态下ctDNA与BZQN的结合是自发过程。

图10　BZQN与DNA结合的ITC曲线

药物与生物大分子之间相互作用的作用力主要有静电、氢键和疏水作用。对于DNA - 药物体系，焓值和熵值都为正值，表明BZQN与DNA的作用过程是吸热和熵增的过程，主要作用力是氢键和静电作用。DNA分子周围的水分子在药物与之相互作用的过程中会被挤出，并且结合位点附近的水化层也会因为药物的靠近而失去一部分水分子，DNA和药物的脱水作用都是吸热的过程，并且对于熵增是正贡献[13-14]。因为T△S>△H，则△G<0，所以推测BZQN与DNA的结合是熵驱动过程。

3结论

本文采用光谱法和等温滴定微量热法研究了BZQN与ctDNA相互作用机理及热力学关系，发现ctDNA能使BZQN的荧光发生动态猝灭，推测BZQN主要以嵌插的方式与ctDNA结合，增强了ctDNA的稳定性，微量热实验表明BZQN与ctDNA的结合是熵驱动过程。

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(责任编辑：张凯兵)

Study on Interaction of Quinolinebiquaternary Ammonium Salt with Calf Thymus DNA

Tian Yu1，Liu Hanming2,Chen Jing1，Jin Yijie1，Xia Caifen1*

(1.SchoolofChemistryandMaterialsScience,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China; 2.TheFirstMiddleSchoolofXiaochangCounty,Xiaochang,Hubei432000,China)

Abstract：The interaction between quinolinebiquaternary ammonium salt (BZQN) and calf thymus deoxyribonucleic (ctDNA) was investigated by spectroscopy and isothermal titration calorimetry (ITC). The results indicated that BZQN had significant fluorescence. In the presence of ctDNA, the fluorescence of BZQN was quenched and the quenching constant(Ksv) increased as the temperature rose, which fitted the characteristics of dynamic fluorescence quenching. All of the UV spectra, melting experiment and CD spectra showed that the conformation of ctDNA secondary structure had changed because of the intercalation effect between BZQN and DNA. The ITC calculated that the binding point between BZQN and DNA was 4, and the combination process of BZQN and DNA was driven by entropy.

Key Words：quinolinebiquaternary ammonium salt (BZQN); calf thymus DNA (ctDNA); spectroscopy; isothermal titration calorimetry (ITC)

收稿日期：2016-03-21

作者简介：田瑜 (1995-)，女，山西晋中人，湖北工程学院化学与材料科学学院学生。

中图分类号：S481.1

文献标志码：A

文章编号：2095-4824(2016)03-0016-06

夏彩芬 (1979-)，女，湖北武汉人，湖北工程学院化学与材料科学学院副教授，本文通信作者。