聚羟基丙烯酸和4%中性缓冲甲醛对苏木精伊红染色及荧光原位杂交检测乳腺癌HER-2基因影响的比较

陈志强，王 莹，米贤军，陈 昂，钟守军，黄华勇，邓文同，刘超凡，徐秀梅，代新珍

南方医科大学附属中山博爱医院病理科，广东 中山528400



聚羟基丙烯酸和4%中性缓冲甲醛对苏木精伊红染色及荧光原位杂交检测乳腺癌HER-2基因影响的比较

陈志强，王 莹，米贤军，陈 昂，钟守军，黄华勇，邓文同，刘超凡，徐秀梅，代新珍

南方医科大学附属中山博爱医院病理科，广东 中山528400

［摘要］背景与目的：适当的组织固定、透明脱蜡是苏木精伊红(hematoxylin eosin，HE)染色及荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH)检测乳腺癌HER-2基因一个重要的步骤。该研究旨在对比环保固定液聚羟基丙烯酸和4%中性缓冲甲醛固定制作的组织切片HE染色优良率，荧光原位杂交检测两者固定制作的乳腺癌组织切片的HER-2基因扩增阳性率，探讨其替代传统固定液4%中性缓冲甲醛的可行性。方法：收集中山市博爱医院2011年3月—2015年1月门诊及住院部送检的乳腺癌69例、乳腺纤维腺瘤41例、子宫平滑肌瘤40例、宫颈组织25例、胎盘组织25例，各取材2块，每例标本的2块组织用抽签法随机分2组，一组采用4%中性缓冲甲醛固定制作HE切片200张，另一组采用聚羟基丙烯酸固定制作HE切片200张。依据切片染色情况判定切片等级，采用SPSS 19.0比较两者HE染色优良率；两组乳腺浸润性导管癌组织再各制作切片69张，采用SPSS 19.0比较FISH技术检测的HER-2基因扩增率。结果：① 聚羟基丙烯酸、4%中性缓冲甲醛固定组组织切片HE染色优质片分别为155张、166张，优良片41张、33张，中等片3张、1张，差片1张、0张，染色优良率分别为98.0%、99.5%，两组间优良率差异无统计学意义(χ2=1.33，P=0.25)。② 聚羟基丙烯酸、4%中性缓冲甲醛固定组组织切片FISH阳性率分别为26.09%、23.19%，两组间阳性率差异无统计学意义(χ2=0.50，P＞0.05)。结论：聚羟基丙烯酸固定制作的组织切片HE染色效果及荧光原位杂交检测乳腺癌HER-2基因扩增效果跟传统固定液4%中性缓冲甲醛相比差异无统计学意义，符合环保要求，有推广使用的可能。

［关键词］聚羟基丙烯酸；甲醛；组织切片；苏木精伊红染色；乳腺癌；HER-2基因；荧光原位杂交

Correspondence to: CHEN Zhiqiang E-mail: 765228687@qq.com

甲醛固定组织制作蜡块是苏木精伊红(hematoxylin eosin，HE)染色及荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH)检测乳腺癌HER-2基因必不可少的步骤。但甲醛具有刺激性，并增加周围人群免疫疾病和癌症的风险［1］。随着人们环保意识的提高，甲醛的危害性逐渐让人们产生能否寻求作为病理学固定“金标准”试剂［2］-4%中性缓冲甲醛环保替代品的想法。事实上，在过去的20年中，国内外学者一直在尝试使用各种新型环保固定剂替代甲醛应用于病理工作的研究。本研究旨在探讨环保试剂替代传统试剂在HE染色、FISH技术中的可行性，为摸索出绿色病理所需之环保产品提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及仪器

聚羟基丙烯酸固定液由广州市艾发生物医学技术工程有限公司生产(单纯固定液，工作液是纯溶液，固定速度是1 mm/h，第一类医疗器械生产企业登记证号：20090363，10～30 ℃温度下保存)。甲醛溶液为广州市东红化工厂生产，苏木精染液(哈瑞氏)、伊红染液(醇溶性)由中国上海宏兹实业有限公司生产。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自动密闭式组织脱水机、DRS-2000J-D2全自动染色机均为日本樱花检验仪器株式会社生产。Thermo HM325轮转石蜡切片机为德国Thermo公司生产，切片厚度2～3 μm。BJ43-PAS8000病理图像分析仪由北京市中西集团公司生产。OLYMPUSBx51荧光显微镜由日本奥林巴斯株式会社生产。探针：TERC探针由中国北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，为GLP HER-2/CSP17探针。

1.1.2 标本来源

中山市博爱医院2011年3月—2015年1月门诊及住院部送检的各种组织标本200例，分别固定在4%中性缓冲甲醛液及聚羟基丙烯酸溶液中12 h。其中大标本有：乳腺癌69例、乳腺纤维腺瘤41例、子宫平滑肌瘤40例、胎盘组织25例，同一病变部位各取材2块，组织按照标准取材大小（1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm）切取。小标本有宫颈组织25例，同一病变部位各取材2块，按照0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm大小取材。69例乳腺癌患者均为女性，年龄33～76岁，平均(54.2±2.5)岁。术前未行任何辅助治疗(内分泌治疗、放疗、化疗)，病理诊断均为乳腺浸润性导管癌。各标本均见明显的肿瘤。

1.2 实验方法

1.2.1 组织处理

活体组织分别直接置于聚羟基丙烯酸和4%中性缓冲甲醛液中，量是标本体积的10倍，标本固定12 h后取材。置于全自动组织脱水机中进行脱水、透明和浸蜡等处理。详细步骤如下：聚羟基丙烯酸和4%中性缓冲甲醛液分别固定2 h，75%、80%、85%、90%、95%、100%、100%乙醇分别固定1 h、1 h、1 h、1 h、50 min、50 min、45 min，二甲苯×2各50 min，石蜡×4各45 min，次日上午7:30包埋、切片厚2～3 μm，裱片于防脱片载玻片上。

1.2.2 传统HE染色

两组切片分别经二甲苯×3各5 min，100%、95%、80%、75%乙醇各3 min，流水洗，苏木精染12 min，流水洗，1%盐酸乙醇分化数秒，流水洗，1%氨水返蓝1 min，流水洗，1%醇溶性伊红染1 min，70%、95%乙醇各30 s，100%乙醇×2各2 min，二甲苯×2各2 min，中性树胶封固。每张组织切片的HE染色均在相同的条件下进行，以保证结果的客观性和可信度。

1.2.3 HE结果的判断与评分

对常规病理切片染色结果的评定借助BJ43-PAS8000图像采集分析仪采用的标准是色度分析，依据中国常规病理切片质控中心推荐的质控评分标准［3］，评议内容包括：脱蜡度、透明度、着色度和颜色鲜亮度情况等。评议结果分为4级：优质、优良、中等、差。具体标准是：

① 优质：脱蜡好、透明度好、着色适中、颜色鲜亮的切片；② 优良：测试片中所有组织染色都很好，但是有些背景；③ 中等：测试片中所有组织染色普遍较弱，或出现大量背景；④ 差：测试片中所有组织染色非常弱，或根本不染色。切片优良率=(优良片数+优质片数）/总切片数。

1.2.4 乳腺癌样本玻片FISH预处理程序

将组织切片置于65 ℃过夜烘烤，老化玻片。将组织切片浸于二甲苯中脱蜡、复水。50 ℃下用质量分数为300 g/L酸性亚硫酸钠处理组织切片20～30 min。90 ℃下用水处理组织切片30 min。室温下于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5 min。将组织切片浸泡在200 µg/mL蛋白酶K工作液中，37 ℃下温育5～30 min，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5 min。室温下于聚羟基丙烯酸和4%中性缓冲甲醛固定液中分别固定10 min。室温下将组织切片玻片依次置于梯度乙醇脱水，加热玻片至56 ℃。

1.2.5 标本准备及变性玻片和探针混合液

在质量分数为70%的甲酰胺/2×SSC变性液中，温度72～74 ℃变性5 min，-20 ℃预冷的70%、85%和100%乙醇梯度脱水各3 min，玻片自然干燥，置于45～50 ℃烤片机上预热2～5 min后与探针杂交。

1.2.6 探针与样本杂交

将变性后的探针混合液10 μL滴于玻片杂交区域，将玻片置于预热的湿盒中，42 ℃保温箱中过夜杂交。

1.2.7 玻片洗涤

将玻片置于3瓶50%甲酰胺/2×SSC溶液中，各漂洗10 min；将玻片置于2×SSC溶液中，漂洗10 min；将玻片置于0.1% NP-40/2×SSC溶液中，漂洗5 min；将玻片室温浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min。

1.3 结果观察

首先在HE染色切片上确认癌细胞区域，然后在10倍物镜下，在FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构，仔细观察信号。在40倍物镜下扫描整张切片，观察是否存在HER-2表达的异质性，以及标本的质量，满意的标本应在75%以上。癌细胞核中都有杂交信号，在100倍物镜下观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算［4］。计数30个细胞，统计Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。

1.4 结果分析

计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，细胞核轮廓不清或有重叠的不分析，杂交不均匀的区域不分析。背景深影响信号判断的区域不分析。在分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位(需由病理科医师认定)。如果超过25%的细胞核内信号太弱，则该区域不进行分析。如果超过10%的细胞质内有信号，则该区域不进行分析。

1.5 结果判断

Ratio值＜1.8为阴性结果，提示该样本无HER-2基因扩增；Ratio值＞2.2为阳性结果，提示样本中HER-2基因发生扩增；Ratio值介于1.8~2.2之间时，可以选择增加计数细胞至100个，或重做FISH实验来判断最终结果。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。切片HE染色优良率、FISH结果符合率的差异均用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色

两组固定液制片HE色彩鲜艳，细胞核与细胞质对比分明(图1、2)。聚羟基丙烯酸、4%中性缓冲甲醛固定组组织切片HE染色优质片分别为155张、166张，优良片41张、33张，中等片3张、1张，差片1张、0张。染色优良率分别为98.0%、99.5%，两组间优良率差异无统计学意义(χ2=1.33，P=0.25)。

图1　聚羟基丙烯酸固定后宫颈组织HE染色结果Fig.1 The results of HE staining in cervical tissues fixed by poly hydroxy acrylic acid

图2　4%中性缓冲甲醛固定后宫颈组织HE染色结果Fig.2 The results of HE staining in cervical tissues fixed by 4% neutral buffered formaldehyde

2.2 FISH检测结果

两组固定液制片，采用FISH检测乳腺癌HER-2表达，荧光显微镜下均发出可被肉眼识别的荧光信号，背景清晰(图3、4)。聚羟基丙烯酸、4%中性缓冲甲醛固定组组织切片FISH阳性率分别为26.09%、23.19%，两组间阳性率差异无统计学意义(χ2=0.50，P=0.5，表1)。

表1　两组固定液制片乳腺癌HER-2基因FISH检测结果Tab.1 Detection results of HER-2 gene by FISH with two groups of fixative solution in producing section

图3　聚羟基丙烯酸固定后乳腺癌HER-2基因检测结果Fig.3 Detection results of HER-2 gene in breast cancer tissues fixed by poly hydroxy acrylic acid

图4　4%中性缓冲甲醛固定后乳腺癌HER-2基因检测结果Fig.4 Detection results of HER-2 gene in breast cancer tissues fixed by the 4% neutral buffered formaldehyde fixative solution

3 讨 论

优质的HE切片仍是临床的病理诊断最根本的依据。其制作需经过一系列技术流程，其中最关键的就是组织固定，组织标本常用4%中性缓冲甲醛固定。乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，HER-2是浸润性乳腺癌的重要临床生物标志物，HER-2受体阳性与乳腺癌不良预后有关，并认为是独立于其他因素之外的指标，其意义不亚于淋巴结转移情况对乳腺癌预后的影响。HER-2状态应该在所有新诊断和复发性乳腺癌中确定［5-7］。Shirsat等［8］指出乳腺癌靶向基因FISH检查可作为HER-2基因状态常规管理的一个低成本筛查。

将组织浸入某些化学试剂，使组织、细胞内的物质尽量保持其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为固定［9］。恰当的固定液应该在一定的温度下，能省时省力又能确保效果。固定不当的标本，细胞的通透性降低，对染料的物理化学作用减弱，附着力降低，生物染料的发色团和助色团很难与被染物结合，造成在组织切片染色定位不佳，模糊不清，甚至没着色等现象，直接延误病理诊断［10-12］。

4%中性缓冲甲醛固定液一直是病理界固定的权威试剂，近年来随着人们环保意识的增强，人们发现甲醛暴露可导致蛋白质生理和病理功能的修改，干扰基因正常表达［13］。国际癌症研究机构认定甲醛是环境污染物，主要模式是DNA-蛋白质交联的形成，使细胞的细胞毒性和细胞凋亡增加，特别是作用于造血干细胞上［14］，引起鼻咽癌、白血病［15］，使孕期的胎儿患肾母细胞瘤风险增加［16］。在马德里召开的第二次国际科学会议讨论了甲醛遗传毒性，大量新的科学数据表明甲醛主要影响外源性和内源性生物DNA的形成［17］。

环保试剂近几年来一直是国内外大医院极力推荐的试剂，国外已有使用无害化学试剂替代4%中性缓冲甲醛固定液进行病理制片的相关报道［18-20］，国内董愉等［21］报道乙醚酒精固定液固定的冷冻切片HE染色效果最佳。张丽荣等［22］研究证实FineFix固定液与福尔马林液固定的组织进行对比，经FineFix固定的组织形态结构完整，尤其在提取DNA和RNA的质和量上具有明显的优越性。汪伟等［23］研究显示PB-FA混合固定液，经PAS染色后基底膜得到更加清晰的显示，从而提高了肾活检穿刺病理诊断的准确性。裴希等［24］用FAA固定液处理后的眼球，能使纤维组织较多偏硬的巩膜得到软化，易脱水、浸蜡和切片。田玉旺等［25］应用GS环保试剂HE染色，色彩鲜艳，核浆对比分明，与传统HE染色结果相比差异无统计学意义。

以荧光标记DNA进行FISH对检测乳腺癌石蜡组织HER-2原癌基因的核苷酸序列技术方法而言是公认的比较成熟的、比较权威的方法［26］。Rosa等［27］研究证实人HER-2在20%~30%的原发性浸润性乳腺癌中有基因扩增和蛋白的过表达。Lee等［28］对971例浸润性乳腺癌HER-2基因的FISH图像文件进行回顾性分析指出组织前固定可能会影响到HER-2基因扩增状态的结果。美国临床肿瘤学家Portier等［29］指出延迟固定时间1~3 h通过FISH对HER-2检测杂交信号有明显影响。王莹［30］尝试应用环保型GS试剂取代传统试剂，并应用FISH技术检测HPVL1壳蛋白的表达，探讨GS环保试剂对HPVL1壳蛋白检测的影响。张进华等［31］应用GS环保试剂制作的石蜡切片提取DNA，进行实时荧光定量VCR技术扩增，并与常规方法制作的石蜡切片进行比较，结果证实GS液能较好地保存组织中的DNA。Fischer等［32］用非醛固定液固定组织，发现大多数细胞HER-2免疫组化抗原正常表达。

纵观国内外文献，并未见报道聚羟基丙烯酸、甲醛对HE染色优良率及对FISH检测乳腺癌HER-2基因扩增阳性率的差异比较，且上述报道并未对实验数据进行统计学分析。

本研究组织前固定时间为12 h，从取材到制成HE切片时间控制在24 h内符合病理规章制度要求，作者应用新型环保固定液聚羟基丙烯酸组织固定硬组织如乳腺纤维腺瘤，软组织如胎盘组织，大组织如乳腺浸润性导管癌组织，小组织如宫颈组织，质地致密组织如乳腺浸润性导管癌组织，质地疏松组织如绒毛组织，良性组织如乳腺纤维腺瘤组织，恶性组织如乳腺浸润性导管癌这种对固定质量要求比较高的组织。最后大体观察：无因固定不当造成的组织皱缩、变硬、切片不完整、龟裂等现象；从放大40~200倍镜下所见：色彩鲜艳，细胞核与细胞质对比分明，分裂相染色体表现黑蓝色，各种成分层次分明。切片HE染色片的优良率控制在98%以上，符合病理科医疗质量与安全考核方案的规定：标准常规石蜡包埋HE染色片的优良率(优质、优良切片所占的比例)不低于95%，优级率(甲级切片所占的比例)不低于35%，与传统试剂4%中性缓冲甲醛固定液制作的HE染色结果优良率相比差异无统计学意义。

甲醛固定组织的主要作用机制是醛基与氨基基团形成可逆的羟甲基衍生物和稳定的亚甲基桥从而使甲醛和蛋白质发生广泛的交联，可能使甲醛改变许多生物分子，包括核酸和蛋白质［33］。聚羟基丙烯酸固定组织的主要作用机制可能是羟基和羧基基团发生可逆的酯化反应，羧基和氨基集团中和反应，前者生成稳定的酯化物、硬化组织，后者维系稳定的反应条件，从而使聚羟基丙烯酸和蛋白质发生广泛的交联［34］。

本研究中聚羟基丙烯酸固定乳腺浸润性导管癌组织，切片HER-2基因FISH阳性率为26.09%，4%中性缓冲甲醛固定乳腺浸润性导管癌组织，切片HER-2基因FISH阳性率为23.19%，与刘秋雨等［35］报道的44例乳腺癌FISH检测HER-2基因，阳性10例，阳性率为23%，基本一致。

综上所述，应用聚羟基丙烯酸无毒、无挥发、固定效率高，减少了甲醛对环境的污染，改用新型环保组织固定液具有环保与学术价值。然而，迄今为止，因在质量控制、标准化、成本价格和毒力试验等方面原因，没有哪个环保固定液替代品能撼动4%中性缓冲甲醛的地位，环保固定液应用在组织前固定只停留在试验阶段：HE染色组织形态好，但由于本研究并没囊括病理科所有标本种类的固定，作为一种新型环保试剂问世时间短，远期效果还有待在多种组织大样本量去验证。FISH检测乳腺癌HER-2基因效果佳，虽然与4%中性缓冲甲醛相比较阳性率差异无统计学意义，但到底以哪个阳性率为准会对后期指导个体化治疗产生不同的后果。如果结合检测同一标本使用2种固定液的HER-2的免疫组化染色，以初步确定不同的阳性率是聚羟基丙烯酸固定产生的假阳性还是4%中性缓冲甲醛固定产生的假阴性又或是存在手工操作存在差异的可能，效果可能会更佳。

［参 考 文 献］

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Comparison of the role that poly hydroxy acrylic acid plays in the detection of HER-2 gene in breast cancer by hematoxylin and eosin staining and fluorescence in situ hybridization with that of 4% neutral buffered formaldehyde

CHEN Zhiqiang， WANG Ying， MI Xianjun， CHEN Ang， ZHONG Shoujun， HUANG Huayong， DENG Wentong LIU Chaofan， XU Xiumei， DAI Xinzhen （Department of Pathology， Zhongshan Boai Hospital Affiliated to Southern Medical University， Zhongshan 528400，Guangdong Province， China）

［Key words］Poly hydroxyl acrylic acid； Formaldehyde； Tissue section； Hematoxylin eosin staining； Breast cancer； HER-2 gene； Fluorescence in situ hybridization

［Abstract］Background and purpose: Adequate tissue fixation， transparent dewaxing is an important step of hematoxylin eosin （HE） staining and fluorescence in situ hybridization （FISH） in detection of breast cancer HER-2 gene.The purpose of this study was to make a comparison between poly hydroxyl acrylic acid which is an environmentally friendly fixation liquid and 4% neutral buffered formaldehyde in tissue fixation for HE staining and FISH to detect the HER-2 gene in the breast cancer tissue sections.The study aimed to evaluate the feasibility of replacing 4% buffered formaldehyde， a traditional fixation liquid， with the poly hydroxyl acrylic acid， an environmentally friendly fixationfluid.Methods: This project was performed on tissue samples collected from 69 cases of breast cancer， 41 cases of breast fibroadenoma， 40 cases of uterine leiomyoma， 25 cases of cervical tissue， 25 cases of placenta obtained from the outpatient and inpatient departments of Zhongshan Boai Hospital from Mar.2011 to Jan.2015， from each of which two samples were drawn and two blocks of each specimen were divided into two groups randomly.Then one group was fixed with 4% neutral buffered formaldehyde and made into 200 sections by HE while the other group was fixed with poly hydroxyl acrylic acid and made into another 200 sections.The slice level of the two groups was determined by the staining condition of the sections， and SPSS 19.0 was employed to compare the excellent and good rate of HE staining.Additional 69 sections were produced with two groups of breast invasive ductal carcinoma tissues， and SPSS 19.0 was used to detect the amplification of HER-2 gene by FISH.Results: First， the number of best-quality slices stained with HE fixed separately by poly hydroxyl acrylic acid and 4% neutral buffered formaldehyde was 155 and 166， respectively.The number of excellent pieces was 41 and 33， respectively， while the number of mediocre pieces was 3 and 1 with bad pieces being 1 and 0， respectively.The excellent and good rates of HE staining were 98% and 99.5%， respectively.There was no significant difference between the two groups （χ2=1.33， P＞0.05）.Second， the positive rates of the tissue slices by FISH fixed separately by poly hydroxyl acrylic acid and 4% neutral buffered were 26.09% and 23.19%，respectively.There was no significant difference between the two groups （χ2=0.50， P>0.05).Conclusion: The results obtained with HE staining and FISH using poly hydroxyl acrylic acid as a fixation liquid are not significantly different from those using 10% neutral buffered formaldehyde.Therefore， poly hydroxyl acrylic acid meets the requirements of environmental protection， and thus has the potential to be promoted and widely used.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.2.001

中图分类号：R737.9

文献标志码：A

文章编号：1007-3639(2016)2-0121-07

基金项目：广东省医学科研基金立项课题（A2011746）；中山市科技计划项目重大专项（20113A004）；中山市局立项课题（2014J128）。

通信作者：陈志强 E-mail：765228687@qq.com

收稿日期：（2015-06-18 修回日期：2015-09-13）