离体心肌粘弹性的印压蠕变试验检测及其病理机制研究

李进嵩，黄 晶，张春晓，邓辉胜，江永红，朱 悫，袁侨英(.四川省医学科学院·四川省人民医院心内科，四川 成都 6007；.重庆医科大学超声影像学研究所，重庆医科大学附属第二医院心内科，重庆 40000；.重庆交通大学，重庆 400074)

离体心肌粘弹性的印压蠕变试验检测及其病理机制研究

李进嵩1，黄 晶2，张春晓3，邓辉胜2，江永红2，朱 悫2，袁侨英2
(1.四川省医学科学院·四川省人民医院心内科，四川 成都 610072；2.重庆医科大学超声影像学研究所，重庆医科大学附属第二医院心内科，重庆 400010；3.重庆交通大学，重庆 400074)

目的 通过生物力学实验和印压方法检测正常和心肌梗死心肌粘弹性的改变及其病理机制分析。方法 应用自行研制的印压实验装置通过印压蠕变试验分别检测保持活性的离体犬陈旧性梗死心肌(OMI组)和正常心肌(正常组)试件粘弹性特征参数(E、E1、E2、η、τ)；并检测试件胶原含量、胶原容积分数(CVF)及I/III型胶原纤维比例。对心肌粘弹性参数与胶原含量、CVF、I/III型胶原比例分别进行相关分析。结果 OMI组粘弹性特征参数(E、E1、E2、η)、胶原含量、胶原容积分数、I/III型胶原比例均高于正常组，差异有统计学意义(P< 0.05)；两组胶原含量、CVF与E、E1、η呈高度正相关(P<0.05)，正常组I/III胶原比例与E1、E呈高度正相关，OMI组则与E1呈正相关(P<0.05)。结论 印压法可检测心室肌粘弹性特性；心肌梗死后弹性模量和粘性阻力均增高；心肌胶原增生及重构对心肌粘弹性有显著影响。

犬离体心室肌；负荷-形变印压实验装置；印压蠕变试验；心肌粘弹性；心肌梗死；心肌胶原纤维

心脏是一个具有丰富力学特性的器官，全面认识心脏功能需要对其生物力学特性有深刻的认识[1]。松弛心肌具有滞后、蠕变、应力松弛等粘弹性特性[2]。以往在体外通过单轴拉伸小梁肌等研究心肌粘弹性特性[3]。然而单轴拉伸法研究的只是心肌纤维轴向的力学特性，而忽略了心腔内血液施加在心肌上的力学效应，且难以在活体研究其与生理功能的关系。近来借助心脏核磁共振作图的方法来研究心脏生物力学特性亦无法做到精确性评估[4]。自1912年Schade应用印压装置研究皮肤蠕变特性以来，应用探头印压组织，同时测定组织受力和相应形变的印压方法已被应用于肌肉、肺等组织硬度、粘弹性等生物力学特性的研究。结合本课题组前期以印压法检测兔离体心肌僵硬度的研究基础[5]，本课题利用自行研制的负荷-形变印压实验装置，对保持活性的犬离体心室肌试件进行蠕变试验检测心肌梗死后心肌粘弹性特征参数的改变并进一步探讨导致心肌粘弹性改变的病理机制。

1 材料与方法

1.1 试验试件制备 健康成年杂种犬6 只(重庆医科大学实验动物中心提供)，雌雄不限，体重(10.4±2.3)kg。腹腔注射麻醉后，以结扎冠状动脉前降支法建立急性心肌梗死模型，术后抗感染1 周，饲养3 个月构建陈旧性心肌梗死模型。随后模型犬麻醉后开胸，10% KCl注射使心脏停跳于舒张期，迅速剪下心脏。在盛有4 ℃生理盐水冰浴中浸泡清洗，然后将左心室梗死后瘢痕形成的陈旧性梗死心肌和正常心肌分别剪下制作成约20 mm×20 mm试件，分为陈旧性梗死心肌组(OMI组)和正常心肌组(正常组)。

1.2 主要试验设备 负荷-形变印压实验装置由重庆医科大学与重庆交通大学共同研制，结构见图1。主要构件包括数显千分表(精确度0.001 mm，成都远恒精密测控技术有限公司)和各种不同直径的圆柱形探头(4 F、6 F、8 F、4 mm等直径，重庆钟表厂定制)，探头底端平整。工作原理：通过在漏斗中加减载砝码可调节所需施加载荷大小。心肌所承受的力为砝码重力加上系统自重力，心肌发生的形变可由数显千分表直接实时显示。系统中轴垂直于试件。

图1 负荷-形变印压实验装置结构示意图

1.3 印压蠕变试验 Gupta等研究表明[6]，通过心脏停跳液浸泡心室肌试件约2 h后其心肌拉伸的应力-应变曲线无显著变化。本研究离体心肌蠕变试验可以在30 min内获得足够数据来描绘心肌整个蠕变过程，故本研究中用K-H液(Sigma 公司)保持离体心肌力学活性是恰当的。用负荷-形变印压实验装置选用合适探头在试件中心印压，预先加载、减载3 次，进行预调处理。然后使试件承受恒定载荷后，记录形变随时间变化的过程，每次记录均在形变连续三个值之间差值小于规定计数后结束。时间设定：试验数据采集从轻轻释放载荷时刻开始，从数显千分表读取心肌形变数值，每5 s采集一个数据。试验时间进行到一定时刻，蠕变试验数据变化趋于平稳，记录结束。将获得的印压蠕变试验数据按照印压蠕变理论方程进行曲线拟合，可分别获得正常组和OMI组E、E1、E2、η、τ等粘弹性参数。

研究表明有诸多模型可以用于心脏和心肌生物力学特性描述[7]，而三参量模型能较好的用于粘弹性材料的印压蠕变试验分析[8]，对于圆柱形平底印压探头，其印压蠕变理论方程：

F为作用在试件上的力，υ为被测对象的泊松比，D为印压探头直径，δ为蠕变稳定后的印压深度。基于心肌是不可压缩粘弹性材料泊松系数约为0.5，故本实验研究中υ取值0.5。

1.4 心肌胶原含量测定 参照Bergerman[10]方法测定经印压检测的正常组和OMI组试件心室肌羟脯氨酸浓度，计算两组心肌胶原含量。主要仪器：紫外可见分光光度计Ultrospec 2100 pro(AmerSham Biosciences公司)。主要试剂：羟脯氨酸测试盒(样本硷水解法，南京建成生物工程研究所第一分所生产)。测定方法参照羟脯氨酸测试盒说明书 VI(样本硷水解法)中的步骤进行。胶原浓度(%)=羟脯氨酸浓度×7.46，7.46为羟脯氨酸换算成胶原时的计算常数；胶原含量=胶原浓度×试件湿重。

1.5 心肌胶原容积分数(CVF)和胶原比例检测 采用苦味酸天狼猩红染色法测定CVF和偏振光法测定I/III型胶原纤维比例。经天狼猩红染色和偏光镜观察后用Image-Pro Plus 5.1病理影像图文分析系统软件进行CVF和I、III胶原比例半定量分析，于左心室梗死区和非梗死区非血管区随机选择5个视野，用上述分析系统检测胶原面密度(area)占整个图片面密度(area)比值代表其CVF。I型和Ⅲ型面密度(area)之比代表I/Ⅲ型胶原比例。

1.6 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示。经正态性检验，所有指标属于正态分布，两组间比较采用两样本t检验，两变量间采用直线相关分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蠕变试验结果 获得的印压蠕变试验数据经Microcal Origin6.0 软件按照上述印压蠕变理论方程进行曲线拟合，曲线拟合中决定系数R2、相关指数R都在0.95以上(P<0.001)，拟合效果好，见图2。OMI组心肌粘弹性特征参数E、E1、E2、η高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组参数τ比较，差异无统计学意义(P>0.05)。OMI组E、E1、E2、η分别较正常组增加了约80%、83%、63%、80%和53%，τ下降约10%。杨氏模量等弹性模量增加最明显，E2> E1，单位应变下的阻尼应力远远大于单位应变下的弹性应力，见表1。

图2 离体心肌蠕变试验数据曲线和拟合曲线

表1 两组离体心肌粘弹性特征参数比较

2.2 心肌胶原含量、CVF、I/III胶原比例检测结果

OMI组胶原含量、CVF、I/III胶原比例明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组心肌胶原含量、CVF、I/III胶原比例比较

2.3 胶原含量、CVF、I/III胶原比例与心肌粘弹性参数的相关性分析 两组胶原含量、CVF与粘弹性参数E、E1、η呈高度正相关(P<0.05)，与E2、τ无相关(P> 0.05)。正常组I/III胶原比例和粘弹性参数E1、E呈高度正相关，与参数E2、η呈负相关(P< 0.05)，与τ无相关(P> 0.05)。OMI组I/III胶原比例和粘弹性参数E1呈正相关(P<0.05)；与E、η、E2、τ无相关(P> 0.05)，见表3。

表3 心肌胶原含量、CVF、I/III胶原比例与心肌粘弹性参数相关性分析

3 讨论

研究表明，确定心脏舒张功能的主要因素是心肌在应力作用下发生应变的能力，在舒张中晚期起主导作用，粘弹性模型能准确地反映舒张期心肌力学特性[11]，准确定量评估舒张期心肌粘弹性特性能加深对心肌和心脏功能的深入认识[12]，进而对舒张性心力衰竭防治有较大临床意义。

从本试验蠕变曲线可以得知，在发生蠕变时心肌形变过程经历了一个初始的快速变化相和其后的缓慢蠕变相，说明心肌在外加阶跃载荷作用下先表现出一个弹性响应阶段(阶跃变形)，其后再显示粘性响应的过程(蠕变)[13]。因此心肌弹性成分和粘性成分共同决定了舒张期心肌形变，这两个因素可能通过不同的途径对心肌顺应性产生不同的影响，弹性成分影响心肌形变程度，而粘性成分影响心肌形变速度[14]。本研究在定量评估心肌弹性和粘性成分方面做了有益探索。同时，试验测得离体正常和梗死心肌杨氏弹性模量约为11.93 kPa和20.50 kPa，表明活体正常心肌硬度很低，这与Pislaru等[15]通过开胸以超声剪切波检测活体心肌粘弹性僵硬度结果接近。

Stroud等[16]研究表明，胶原纤维是细胞外基质影响心肌粘弹性的主要决定因素，心肌间质纤维化增加引起的结构改变将导致心肌被动弹性特征改变。I型、Ⅲ型胶原是组成纤维性胶原网的主要成分，对维持心脏正常结构和功能十分重要。在某些疾病状态下，如心肌梗死后，胶原的数量及分布发生改变(即胶原重构)，引起心肌间质纤维化，当间质含量由正常3%～5%增至8%～12%时，心肌收缩和舒张的应力—应变关系均升高，室壁顺应性下降，影响心肌收缩及舒张功能，但以舒张功能障碍出现较早[17]。

本研究表明，心肌梗死90天后犬梗死区心肌胶原含量比对照组高近3倍，而梗死心肌的弹性模量和粘性阻力系数比对照组分别增加约4倍和3倍。从胶原容积分数和心肌粘弹性参数的相关性分析表明，胶原容积分数增加，胶原增生使得舒张心肌的弹性模量、粘性阻力增加，表明心肌胶原含量对心肌弹性和粘性阻力的影响是正相关的，心肌胶原含量越多，心肌越僵硬，形变时要克服的粘性阻力越大。这也从定量方面证实心肌梗死后胶原增生可增加心脏的僵硬度，与Stroud等[16]关于降低心肌组织胶原的含量将降低心肌的弹性硬度和粘性阻力的研究一致。同时犬梗死区在经过90天后心肌I/Ⅲ 比值仍然比正常值高，说明I型胶原的增生一直持续，然后可能维持在某个水平。I/III型胶原比例与弹性模量的相关关系也可以解释胶原的过度增生尤其是I型胶原的增多，增加了心肌的僵硬度。正常组心肌与E2、η参数的负相关表明，I型胶原的增多和III型胶原纤维的下降使得心肌的粘性阻力增加，I/III型胶原纤维比例的下降，即III型胶原纤维增生为主将会一定程度上改善心肌的舒张，这与Weber推测胶原纤维的分布、比例改变影响心肌力学特性相一致[18]。心肌梗死后期可能由于长期应力增加的作用使得心肌胶原的增生又以I型为主。梗死心肌粘弹性参数E2、η与I/III型胶原纤维比例失去了相关性，显示陈旧性梗死心肌失去调节I/Ⅲ 比值的代偿能力。因此，从心肌舒张能力层面可以解释这样一种结果，胶原纤维尤其是I型胶原的进行性沉积是缺血性心肌病舒张功能低下的一个重要决定因素。胶原改建早期I/Ⅲ胶原比例下降增加心肌顺应性作为代偿，随后由于长期高应力状态下胶原组成发生变化，表现为I/Ⅲ型胶原比例增加，这有利于减少梗死区、减少室壁瘤形成，但却增加了心室僵硬度，室壁舒张顺应性降低，心肌舒张能力下降。

本实验表明，印压蠕变方法研究是可靠的、可行的。因此，印压蠕变试验可以用于离体心肌粘弹性的检测，印压方法是一种直接可行的评估心室肌粘弹性的方法，具有可用于活体研究的优势。心肌梗死后心肌粘弹性参数改变的检测可以从力学层面深入认识心脏舒张功能的病理生理机制。深入认识心肌粘弹性特性对心脏舒张功能的影响，掌握不同病变心肌粘弹性变化特点，有助于治疗策略的优化，有针对性地调整临床治疗策略，如以降低粘性阻力为目标的方法和药物，可为舒张性心力衰竭的治疗提供新的靶点。同时评估不同生理和病理状态下舒张期心肌粘弹性特性改变，更早地检测出心肌舒张功能异常，可以为舒张功能障碍早期诊断提供依据和新的技术、手段。

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Viscoelasticity of myocardium through indentation creep test in vitro and the analysis of its pathological mechanism

LIJin-song1，HUANGJing2，ZHANGChun-xiao3，DENGHui-sheng2，JIANGYong-hong2，ZHUQue2，YUANQiao-ying2
(1.DepartmentofCardiology，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China； 2.InstituteofUltrasoundImaging，DepartmentofCardiology，TheSecondAffiliatedHospital，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400010，China； 3.ChongQingJiaoTongUniversity，Chongqing400074，China)

HUANGJing

Objective To investigate the changes of myocardial viscoelasticity in normal and in myocardial infarction through biomechanical trial and indentation creep test，and analyze its pathological mechanism.Methods The viscoelastic characteristic parameters(E、E1、E2、η、τ)of canine test pieces from old myocardial infarction (OMI group) and normal myocardium (normal group) were detected by indentation creep test with self-made load-deformation indentation experimental facility.At the same time，the collagen content，the collagen volume fraction (CVF) and the proportion of type I and III collagen were detected.Correlation analysis between the parameters of myocardial viscoelasticity and collagen content，CVF and type I/III collagen were carried out respectively.Results The viscoelastic parameters，collagen content，CVF and the ratio of collagen type I/III in the OMI group were significantly higher than that in the normal group (P< 0.05).The highly positively correlations between the parameters of E/E1 and collagen content/CVF/collagen type I / III ratio were found (P< 0.05).The highly negatively correlations between the parameters of E2/η and collagen type I / III ratio were found (P< 0.05).Conclusion It is feasible that the indentation creep test can be used to detect the myocardium viscoelasticity.The elastic modulus and viscous resistance are increased after myocardial infarction.The proliferation and remodeling of myocardial collagen have a significant influence on myocardial viscoelasticity.

Isolated canine myocardium； Load-deformation indentation experimental facility； Indentation creep test； Myocardial viscoelasticity； Myocardial infarction； Myocardial collagen

国家自然科学基金资助项目(编号：30371361、30527001)，四川省卫生厅科研基金资助项目 (编号：08038)

黄 晶

R541.4；Q95-33

A

1672-6170(2016)05-0046-05

2016-04-08；

2016-06-22)