不同频率超声联合靶向微泡、尿激酶在体溶栓后对微循环功能变化的实验研究

阿丽米娜·阿文，关丽娜，虎晓梅，穆玉明(新疆医科大学第一附属医院心脏超声诊断科，新疆 乌鲁木齐 830054)

不同频率超声联合靶向微泡、尿激酶在体溶栓后对微循环功能变化的实验研究

阿丽米娜·阿文，关丽娜，虎晓梅，穆玉明
(新疆医科大学第一附属医院心脏超声诊断科，新疆 乌鲁木齐 830054)

目的 观察不同频率超声联合靶向微泡、尿激酶在体溶栓后对微循环功能的影响。方法 18只新西兰大白兔单侧股动脉制成富含血小板的混合性血栓模型，分为A、B、C3组各6只。均通过靶向微泡携带尿激酶在超声照射30 min下辅助溶栓，其中A组超声频率1.6 kHz，B组2.2 kHz，C组2.8 kHz。应用脉冲多普勒血流仪持续监测血流流速，对血流量变化特点进行分析，并对各组胫前肌行HE染色，比较不同频率超声的溶栓作用及对微循环功能变化的影响。结果 溶栓后120 min时，三组血流量变化比较，差异有统计学意义(P< 0.05)，其中B组与A、C组比较实现了完全再通。A、C组均有未溶通或者微栓塞情况发生。经HE染色后发现C组微循环末端有微小栓子，成分为由嗜酸性同质性纤维素构成，镜下呈粉红色。结论 超声频率2.2 MHz的条件下溶栓可以实现血栓的完全溶解，远端未见微栓子形成，栓子处于完全溶解状态。

超声；靶向微泡；溶栓；微循环；微栓塞

血栓形成和血栓栓塞后斑块的破裂产生的碎片及微循环栓塞是任何一个血管手术术后有可能发生的一种并发症，静脉使用溶栓药物的副作用主要是引起出血，其操作复杂、有创、易引发血管壁损伤或发生远端小血管栓塞的缺点，而体表超声助溶不但能有效溶解血栓并且能够使溶栓更加彻底，减少微循环栓塞的发生[1]。有研究报道，在目前先进的支架及手术技术基础上，栓塞率有所下降，微循环栓塞这种并发症的死亡率由过去的4%～17%下降到了0.9%，因此如何减少微循环再栓塞无疑对治疗血管性疾病起到重要作用[2]。既往研究结果显示，应用诊断超声联合靶向微泡携带尿激酶可以完全溶解股动脉内血栓[3]，但同时发现，在实现了靶向血管内血栓的有效溶解后，其末端的分支小血管出现了不同程度的再闭塞。因此，为进一步研究其可能的原因，本研究通过选取不同超声频率联合靶向微泡、尿激酶对兔股动脉血栓进行溶栓，探讨不同频率超声溶栓后对微循环功能及微血栓形成的影响因素与意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型制备 18只新西兰大白兔，由新疆医科大学动物中心提供，体质量1.8～2.8 kg，戊巴比妥钠(30～40 mg/kg)麻醉，建立静脉通道，仰卧位固定，腹股沟区脱毛，备皮，钝性分离组织，分离股动脉，结扎其相应的深支和浅支。在该段股动脉后壁放置大小为2.5 cm×2.5 cm 的橡胶薄膜，以保护动脉周围组织。在橡胶薄膜与股动脉后壁放置一大小约0.5 cm×0.5 cm的浸有15%三氯化铁溶液滤纸片将股动脉环绕包裹，接触面约为股动脉周径的3/4，待血流稳定后，将股动脉的远端用动脉夹夹闭，7～8 min后取出动脉夹，约20 min后取出滤纸片，用生理盐水冲洗局部组织。所有动物的处置均经过新疆医科大学伦理委员会同意(批件号:20140403003)并按照相关规定处理。血栓模型制作成功的标准:①在30 min内形成完全闭塞性血栓；②脉冲多普勒流仪血流量<0.05 ml/min；③二维和彩色多普勒超声显示闭塞性血栓；④经HE染色证实为以血小板为主的混合件混合性血栓。以上标准如有1项不符合即为阴性结果。终止实验标准:自制作模型开始观察，总观察时间120 min后终止实验[4]。

1.2 方法 将0.3 ml的TagestarSA超声微泡与生物素化尿激酶(3 ml)及生物素化RGDS(3 ml)三者混匀，于室温条件下孵育20分钟，期间不断轻微震荡。待血栓形成后，经耳缘静脉通道缓慢注射。将LA523探头置于血栓处，选择爆破条件，待微泡到达血栓处，曝破约10 min，待股动脉内完全看不到造影剂即可停止爆破。使用LA240探头，频率1～4 MHz，照射血栓处30 min，观察两小时。将脉冲多普勒血流计的血流量恢复正常基础血流四分之三以上定义为完全溶通，进一步用二维和彩色多普勒超声加以确定。实验结束后即刻结扎远、近端血管，取出血管后，予过量麻醉药处死动物，切开兔前肢小腿前侧皮肤，钝性分离筋膜组织，取胫前肌组织2 cm×1.5 cm，厚度为0.2 cm，标本用4%福尔马林溶液固定，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色，观察组织末端血管内有无微血栓存在。

1.3 溶栓疗效评价指标 血管再通率: CDFI或血管造影进行评价，以血管再通(达I级:仅见细窄血流通过)为标准[5]，判断各组溶栓治疗后血管的再通率。

1.4 统计学方法 应用SPSS 23.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，不服从正态分布，采用秩和检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血流量的比较 不同时间段比较三组血流量变化情况，溶栓后120 min时，三组血流量变化比较，差异有统计学意义(P< 0.05)，其中B组与A、C组比较实现了完全再通。见表1。

表1 不同超声频率下溶栓后120 min内股动脉血流量情况 (ml/min)

2.2 三组溶栓后血管的溶通情况及发生微栓塞的情况 根据CDFI血流频谱观察实验结果:三组溶栓后血管的溶通情况及发生微栓塞的情况:A组溶栓后血管部分未溶通，但未发生微栓塞；B组溶栓后血管均完全被溶通，没有发生微栓塞；C组溶栓后有部分血管未溶通，发生了微栓塞。见表2。

2.3 各组超声检查结果 观察不同条件下溶栓后血管溶通的情况溶通组:CDFI可见血流通过，未通组:CDFI未见血流通过。见图1。

表2 不同超声频率下溶栓后血管溶通情况及发生微栓塞的情况

2.4 溶栓后兔胫前肌镜下表现 18只动物中14只血管内血栓均完全溶解，4只未溶通。其中的1只出现了微循环再栓塞，光镜下可见组织存在较明显的瘀血和出血，白细胞聚集，组织呈蜡样变性，提示骨骼肌坏死，微血管中由血小板纤维素和/或红细胞组成，HE 染色呈粉红色，证明微血栓形成。见图2。

图1 靶向微泡、尿激酶溶栓后血管再通的超声及造影图像 a:溶通组超声下CDFI血流通过； b:未通组超声下CDFI未见血流通过；c:溶通组造影可见造影剂显影；d:未通组造影下造影剂未显影

图2 溶栓后胫前肌组织血管镜下表现 a:溶通组未发生微栓塞；b:纤维素及血小板组成的粉红色血栓，略透明，箭头所指为微血栓形成 (HE染色，×400)

3 讨论

溶栓后微循环产生的碎片导致微循环栓塞，是溶栓治疗最主要最严重的并发症。本研究也证实，应用不同超声频率联合靶向微泡、尿激酶溶栓，虽然可以溶解血栓，但在末端分支小血管内也可能出现小的碎片。因此，及时发现微小栓子对减少微循环栓塞有重要意义。

通过超声联合微泡溶栓可能会使血栓破碎成小块，但如果碎片大于下游毛细血管的直径，这就会增加二次栓塞的风险[6，7]，研究发现溶栓后可能存在有大小约30～150 μm的游离血栓随着大栓子脱落至管壁，继而随血液循环流动至血管的细小分支导致微循环末端的再次栓塞[8，9]。这种小的栓塞结构经病理HE染色镜下可见其内部为团块状的纤维蛋白结构，观察其周围发现一些散在的红色颗粒，考虑可能为沉淀的红细胞，相比这种较小的栓子，当血栓直径小于150 μm时，血管内可见有纤维素和红细胞组成的粉红色物质，于之前看到的单纯的红细胞聚集形成的血栓不同，在病理HE染色时发现此时镜下的细胞呈粉红色，这种粉红色的物质为微血栓。

血凝块碎片的大小在很大程度上取决于超声照射强度[10，11]。研究表明超声可有效促进血栓溶解，当超声与溶栓药物联合溶栓时，可增加溶栓药物的疗效，使溶栓时间由3 h缩短至30 min[12]。另外，体外溶栓实验结果显示，高强度超声在脉冲模式下会诱发血凝块溶解，这种技术取决于空化效应和组织使用聚焦超声波的频率，由于脉冲时间短(<50个周期)、压力高(>6 MPa)，相对于非线性脉冲空化作用低(0.1%～5%)，可在较短的时间内分离出组织碎片。在血管溶栓治疗的应用中，多普勒超声可有效反馈溶栓情况，5 MHz超声诊断仪被用于监测与治疗血栓疾病，若在超声溶栓的过程中，不断增加频率的范围，首先出现的不良反应为对机体有伤害作用，而且溶栓效果也并没有较低频率溶栓的结果理想，使用频率较低的超声具有通过体积较大的声波作用来改进穿透力与定位的优点[13]。

研究表明[14]，超声频率2.2 kHz，超声照射时间30 min，尿激酶剂量为3 mg时，将溶栓时间控制在10～60 min，随超声照射时间的延长，超声溶栓效果越明显。因此本实验依据要求将超声照射血栓处的时间控制在30 min，我们既往的研究中[15]，由于使尿激酶有了靶向性，成功地降低了尿激酶的剂量(3 mg)，虽然实现了靶向血栓的有效溶解，但可能也存在一部分的尿激酶在血液中被中和后失活，进而导致血液中尿激酶浓度减低，血栓的溶解片段过大，致微循环的再栓塞，因此药物尿激酶的适量浓度也将影响血栓片段大小。不但实现了血管的溶通，并且没有发生碎片，病理证实无微栓塞发生。而其他两组，均有血管未通或(和)微栓塞发生，考虑其可能的原因是由于超声在助溶的同时，可能会对远端小血管产生一定影响，造成血栓溶解片段过大，随微循环在末端分支小血管产生微小的碎片，因此选取适当的超声频率对减少微循环的栓塞有一定的作用。

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The changes of microcirculation function after in vivo thrombolysis by using targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency

ALIMINAA-Wen，GUANLi-na,HUXiao-mei,MUYu-ming
(DepartmentofEchocardiography，TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

MUYu-ming

Objective Objective To observes the effect of targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency on the microcirculation function after in vivo thrombolysis. Methods Eighteen New Zealand white rabbits were divided into A, B and C groups, 6 in each group after establishing a mixed thrombus model richer with platelets in unilateral femoral artery. Auxiliary thrombolysis was performed by using the target microbubbles with urokinase under ultrasound for 30 min, in which the group A

ultrasonic frequency was 1.6 MHz, the group B 2.2 MHz and the group C 2.8 MHz. Blood flow velocity was monitored by using a pulse Doppler blood flow meter and blood flow changes were analyzed. Meanwhile, samples of tibialis anterior muscles were stained by HE and the effects of thrombolysis under different ultrasonic frequency on microcirculation function were compared. Results After 120 min of thrombolysis, blood flow changes were significantly different among the three groups (P< 0.05), in which the group B achieved complete recanalization. There was incomplete recanalization or microemboli in another two groups. The HE staining showed that there was a small dose of microembolism composed of eosinophilic homogeneity of cellulose with pink color under microscopy. Conclusion The ultrasonic frequency 2.2 MHz, irradiation time 30 min, and urokinase of 3 mg thrombolysis can completely dissolve thrombus and can effectively prevent the microembolus formation.

Ultrasound； Targeted microbubble； Thrombolysis； Microcirculation； Micro embolism

国家自然科学基金资助项目(编号:81301230)

穆玉明，男，博士，主任医师，教授，博士生导师。中华医学会超声医学分会常委，中华医学会分会第七届委员会浅表组织和血管超声学组副组长，中华医学会超声医学分会第八届超声心动图学组副组长，中国医师协会超声医师分会常务委员，中国超声医学工程学会常务理事，中国超声医学工程学会超声心动图专业委员会副主任委员，中国医学影像技术研究会超声分会常务委员，新疆超声医学工程学会会长，新疆医学会超声专业委员会主任委员。研究方向:心血管超声。

540.4+5

A

1672-6170(2016)05-0015-04

2016-07-20)