Ki-67的表达与胃癌患者临床病理特征及预后的关系

黄天臣　肖建安　王青兵　王雁军 　张勇 　白东晓　邱新光

1)河南安阳市肿瘤医院外四科　安阳　455000　2)郑州大学第一附属医院普通外科　郑州　450052

Ki-67的表达与胃癌患者临床病理特征及预后的关系

黄天臣1)肖建安1)王青兵1)王雁军1)张勇1)白东晓1)邱新光2)*

1)河南安阳市肿瘤医院外四科安阳4550002)郑州大学第一附属医院普通外科郑州450052

【摘要】目的探讨Ki-67在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化技术，检测326例胃腺癌组织及相应326例正常胃黏膜组织中Ki-67蛋白的表达情况。采用半定量RT-PCR实验检测，随机选取10例胃腺癌组织和相对应的正常胃黏膜组织中Ki-67mRNA的表达情况，应用χ2检验、Kaplan-Meier生存分析及COX 回归分析与患者临床病理特征及预后的关系。结果胃癌组织中Ki-67蛋白和mRNA明显高于正常胃黏膜组织(P<0.05 )。Kaplan-Meier生存分析显示Ki-67蛋白表达与胃癌患者的预后密切相关 (χ2=8.086, P=0.005)，COX 回归分析显示Ki-67为胃癌患者预后的独立因素 (P=0.002 )。结论Ki-67的表达与胃癌预后密切相关，为胃癌患者预后的独立因素。

【关键词】胃癌；Ki-67；临床病理特征；预后

胃癌为消化道肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤。我国是胃癌发病率和病死率最高的国家之一。因此，对于胃癌相关基因及分子标记物的研究对胃癌的早期诊断、治疗、预后评定具有重要的临床意义。Ki-67 是较为肯定的与细胞周期相关的核增殖标志物，仅仅存在于增殖细胞的细胞核内[1]，其表达随细胞周期的进展而增加[2]，为反应细胞增殖活性的重要指标，广泛用于肿瘤细胞的增殖评估。研究表明[3-4]，Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中均有过表达，并且与肿瘤的发生发展、浸润转移及预后相关。研究 ki-67 在胃癌组织中的表达，对评估胃癌细胞的增殖活性及判定预后具有重要意义。

1资料与方法

1.1组织标本来源收集2005-03—2010-03间于安阳市肿瘤医院接受胃癌根治术的326例胃癌患者的手术标本。均排除远处转移，均未接受放化疗、免疫治疗，术后均经过病理确诊。标本应用多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，分别用于HE染色及免疫组织化学染色。新鲜实验标本保存于液氮中，用于半定量RT-PCR实验。正常胃黏膜组织取自手术标本中距癌组织边缘5 cm以上的手术切缘，均经病理学证实为正常的胃黏膜组织。

1.2实验方法

1.2.1免疫组化(1)方法：免疫组织化学方法采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法技术(streptavidin-perosidase, SP技术)，染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。(2)结果判定：采用双评分半定量积分法对Ki-67的免疫组化结果分析。以出现棕黄色或棕色颗粒的细胞作为阳性细胞，Ki-67抗原阳性表达为细胞核呈棕褐色颗粒，在高倍镜下(400倍高倍镜下视野)，随机选取5个视野(每个视野计数的细胞数不少于200个)。评分：阳性细胞<5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。阳性强度评分：细胞无染色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞百分比和阳性强度两项相乘，0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为(++)，≥9分为(+++)，将(++)和(+++)样本认为阳性表达，(-)和 (+)样本认为阴性表达。

1.2.2半定量RT-PCR用Primer 6.0软件辅助设计PCR扩增引物(由上海生工生物技术有限公司合成)，序列如下：人Ki-67引物：上游引物为：5'- GTGAGGGAATACCTTTGA-3'，下游引物为：5'-CCTGATGGTTGAGGCTGT-3'，扩增片段长度191 bp。内参人GAPDH引物：上游引物为：5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，下游引物为：5' -CCTGCTTCACCACCTTCTT-3'，扩增片段长度580bp。使用Trizol法提取组织细胞中总RNA，紫外分光光度计测量总RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。逆转录合成c DNA，取2μl逆转录产物进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃ 5min(预变性)一个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35个循环。72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳实验，最后在紫外灯下观察结果和拍照。

2结果

2.1Ki-67蛋白在胃癌组织与正常胃黏膜组织中的表达应用SP检测326例胃癌及相应的正常胃黏膜组织中Ki-67蛋白的表达。结果显示，Ki-67蛋白主要表达于癌细胞胞核，呈棕黄色颗粒。在326例胃癌组织中，有204例Ki-67 表达阳性，阳性表达率为62.57%。显著高于正常胃黏膜组织(11.96%)，胃癌组与正常胃黏膜组Ki-67 的阳性表达率比较有显著性差异 (χ2=178.602,P=0.000)，见表1。

表1　胃癌与正常胃黏膜组织中ki67蛋白表达比较

2.2RT-PCR检测胃癌和正常胃黏膜组织中Ki-67 mRNA的表达为了进一步证实免疫组化的结果，我们采用半定量RT-PCR分析随机选取的10例胃癌组织和相对应的正常胃组织Ki-67 mRNA表达。结果表明，随机选取的10例胃癌组织中Ki-67 mRNA的表达显著高于相对应的正常胃黏膜组织，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表 2

表2　胃癌和正常胃黏膜组织中Ki-67 mRNA的表达

*：与胃癌组织相比，P<0.05

2.3Ki-67与胃癌临床病理学的关系应用SPSS17.0统计软件分别从性别、年龄、TNM分期、组织分化程度和有无淋巴结转移等方面分析Ki-67蛋白表达与胃癌临床病理学之间的关系，进一步研究Ki-67蛋白在胃癌发生发展过程中的可能作用。结果显示，Ki-67蛋白的表达与胃癌患者的性别、年龄、TNM分期无关(P>0.05)，但与胃癌患者的组组织分化程度及淋巴结转移均密切相关(P<0.05)，见表3。

2.4Ki-67蛋白表达与胃癌病人预后之间的关系

2.4.1预后单因素分析应用Kaplan-Meier生存曲线分析Ki-67蛋白表达与胃癌患者存活时间之间的关系。入组的326例胃癌患者均具有完整的随访资料，术后第1年每3个月随访1次，以后每6个月随访1次。随访形式以门诊复查为主，其次为电话方式。随访时间3～87个月，中位随访时间为36.5个月。将326例胃癌患者的肿瘤分化、TNM分期、淋巴结转移及Ki-67蛋白表达情况进行单因素分析，结果显示，Ki-67蛋白表达与胃癌患者的预后密切相关(χ2=8.086,P=0.005 )(图 1)。同时发现TNM分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度对胃癌患者的预后具有统计学意义 (P<0.05)。

表3　Ki-67蛋白表达与胃癌临床病理学参数之间的关系

图1　Ki-67与胃癌患者生存关系

2.4.2预后多因素分析为进一步明确Ki-67蛋白表达的独立性预后价值，应用COX模型对单因素分析中有显著意义的4个变量进行多因素分析，COX 回归分析显示Ki-67、淋巴结转移及TNM 分期为胃癌患者预后的独立因素 (P<0.05)，而肿瘤分化程度虽然在单因素分析中与胃癌患者预后相关，但经COX回归分析，无明显统计学意义，并非影响胃癌患者预后的独立因素，见表4。

表4　胃癌患者术后生存多因素 COX 回归分析

3讨论

Ki-67是较为肯定的与细胞周期相关的核增值标志物，仅仅存在于增值细胞的细胞核内[1]，所编码的基因位于第10号染色体上，其表达随细胞周期的进展而增加，细胞分裂周期中，G0期不表达，G1后期开始表达，S和G2逐渐升高，M期达到高峰，细胞分裂结束后迅速降解消失[2]，为反应细胞增值活性的重要指标，广泛用于肿瘤细胞的增殖评估。研究表明[3-4]，Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中均有过表达，并且与肿瘤的发生发展、浸润转移及预后相关。

关于胃癌与Ki-67关系的研究已较多，但目前尚存在争议。研究表明，Ki-67在胃癌组织中的表达与肿瘤的临床病理及患者的预后密切相关[5]。Tsamandas等[6]研究认为，Ki-67与胃癌患者预后相关。Kikuyama等[7]认为Ki-67为评估胃癌患者预后的独立的因子。而Oshima等[8]研究表明Ki-67与患者性别、年龄、肿瘤的临床分期及患者预后均无明显相关。Victorzon等[9]则认为Ki-67对于胃癌患者的预后判定无预测价值。本研究结果显示： Ki-67蛋白主要表达于癌细胞胞核，呈棕黄色颗粒，胃癌组织中Ki-67阳性表达率为62.57%，显著高于正常胃黏膜组织(11.96%)，具有显著性差异。应用半定量RT-PCR实验随机检测10例胃腺癌组织和对应的正常胃黏膜组织中Ki-67的表达情况，进一步证实Ki-67在胃癌组织中表达明显高于在正常胃黏膜组织中的表达。

应用SPSS17.0统计软件分别从性别、年龄、TNM 分期、组织分化程度和有无淋巴结转移等方面分析Ki-67蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系，进一步研究Ki-67蛋白在胃癌发生发展过程中的可能作用。结果显示，Ki-67蛋白的表达与胃癌患者的性别、年龄、TNM分期无关，但与胃癌患者的组组织分化程度及淋巴结转移均密切相关。

进一步分析Ki-67蛋白表达与胃癌患者预后的关系。应用Kaplan-Meier生存曲线分析Ki-67蛋白表达与胃癌患者存活时间之间的关系。将326例胃癌患者的病理学资料：肿瘤分化、TNM分期、淋巴结转移及Ki-67蛋白表达情况进行单因素分析，结果显示，Ki-67蛋白表达与胃癌患者的预后密切相关。同时发现TNM分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度对胃癌患者的预后具有统计学意义。为进一步明确Ki-67蛋白表达的独立性预后价值，应用COX模型对单因素分析中有显著意义的4个变量进行多因素分析，COX 回归分析显示Ki-67、淋巴结转移及TNM 分期为胃癌患者预后的独立因素。

4参考文献

[1]Nowieki M, Ostalska, Nowieka D, Miskowiak B, et al. Prognostic significance of Ki-67 negative blaste cell clone in the high risk group of children treated for acute myeloid leukaemi [J]. Folia Histochem Cytobiol, 2006, 44(l): 49-52.

[2]Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67[J]. J Immunol 1984; 133: 1 710‐1 715.

[3]Ogata DC, Marcondes CA, Tuon FF, et al. Sperfical papillary urothelial neoplasmas of the bladder ( PTA E PT1 ): correlation of expression of p53, ki-67 and CK20 with histologic grade, recurrence and tumor progression [J]. Rev Col Bras Cir, 2012, 39(5): 394-400.

[4]Vilar E, Salazar R, Perez-Garcia J, et al. Chemotherapy and role of the proliferation marker Ki-67 in digestive neuroendocrine tumors [J]. Endocr Relat Cancer, 2007, 14 (2): 221-232.

[5]Daniela Lazar, Sorina Taban, I Sporea. Ki-67 expression in gastric cancer [J]. Romanian Journal of Morphology and Embryology 2010, 51 (4): 655-661.

[6]Tsamandas AC, Kardamakis D, Tsiamalos P, et al. The potential role of Bcl-2 expression, apoptosis and cell proliferation ( Ki-67 expression ) in cases of gastric carcinoma and correlation with classic prognostic factors and patient outcome [J]. Anticancer Res 2009 Feb; 29(2):703-9.

[7]Kikuyama S, Kubota T, Shimizu K. et a1. Ki-67 antigen expresion in relation to clinicopathological variables and prognosis in gastric cancer [J]. Oncol Rep, 1998, 5(4): 867-870.

[8]Oshima CT, Iriya K, Forones NM. Ki-67 as a prognostic marker in colorectal cancer but not in gastric cancer [J]. Neoplasma 2005; 52(5): 420 - 4.

[9]Victorzon M, Roberts PJ, Haglund C. et a1. Ki-67 immunoreactivity ploidy and S-phase faction as prognostic factors in patients with gastric carcinoma [J]. Oncololgy, 1996, 53: 182-191.

(收稿2015-12-24)

Association of Ki-67expression with clinicopathologic features and prognosis in gastric cancer

HuangTianchen,XiaoJianan,WangQingbing,WangYanjun,ZhangYong,BaiDongxiao，QiuXinguang.

Thefourthdepartmentofgeneralsurgery,AnyangtumorHospital,Anyang455000 2.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the Ki-67 expression and its clinical significance in gastric cancer. MethodsThe expressions of Ki-67protein in 326 adenocarcinoma of gastric structures and in the corresponding 326 normal gastric mucosa structures will be tested by applying Immunohistochemical Technique.The expressions of Ki-67mRNA in 10 random chosen cases of adenocarcinoma of gastric structures and its corresponding normal gastric mucosa structures will be tested by semi-quantitative RT-PCR. The associationof Ki-67 expression with clinicopathologic features and prognosis in gastric cancer patients were analyzed with various statistical methods，such as χ2 -test，Kaplan-Meier method and COX proportional hazard model.ResultsKi-67 protein and Ki-67 mRNA in the gastric cancer structure clearly is more than that in normal gastric mucosa structure(P<0.05 ). The gastric cancer patient’s survival rate with high expression of Ki-67 is dramatically lower than that with low expression of Ki-67. The expression of Ki-67 is closely related to stomach cancer patient’s prognosis(χ2=8.086, P=0.005). The result of COX proportional hazard model shows that Ki-67 is the independent prognostic factor of stomach cancer patient(P=0.002).ConclusionThe expression of Ki-67 is closely related to the prognosis; Ki-67 is the independent prognostic factor of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Ki-67; Clinicopathologic features;Prognosis

*通讯作者：邱新光，Email：15836387568@163.com

【中图分类号】R392.31

【文献标识码】B

【文章编号】1077-8991(2016)03-0008-04