产纤维素酶地衣芽孢杆菌B.LY02摇瓶发酵条件优化

余祖华，丁　轲，，侯　奎，李元晓，李　旺

(河南科技大学a.动物疫病与公共卫生重点实验室；b.宏翔生物饲料实验室，河南 洛阳 471003)



产纤维素酶地衣芽孢杆菌B.LY02摇瓶发酵条件优化

余祖华a，丁轲a，b，侯奎b，李元晓b，李旺b

(河南科技大学a.动物疫病与公共卫生重点实验室；b.宏翔生物饲料实验室，河南 洛阳 471003)

摘要：为了提高产纤维素酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis LY02，B.LY02)的产酶能力，采用单因素试验对该菌株产酶的摇瓶发酵条件进行了优化。优化结果显示：菌株B.LY02发酵培养基的最适碳源为麦芽糖，氮源为酵母膏，初始pH值为5.0，培养温度为37 ℃，培养时间为30 h，装液量为60 mL(250 mL三角瓶)，接种量(体积分数)为2%，摇床转速180～200 r/min 。通过优化发酵条件，菌株B.LY02的产酶活性达到了0.683 5 U/mL，比优化前提高了约27.73%。

关键词：纤维素酶；地衣芽孢杆菌；发酵条件；酶活

0引言

纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一[1]，但由于其较难降解，所以尚未得到充分利用。学者们一直在探寻降解纤维素的有效方法，比如酸、碱和蒸汽加热等，但这些方法存在降解产物回收率低和二次污染等问题，限制了其应用[2]。目前，利用产纤维素酶的微生物来降解秸秆成为一种更接近自然的纤维素降解方法[3]。地衣芽孢杆菌是目前应用较多的益生菌之一，它自身能合成蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶等消化性酶类[4-7]。因此，利用产纤维素酶的地衣芽孢杆菌对秸秆进行生物降解是处理和利用秸秆最具前景的方法。但自然存在的纤维素酶产率往往较低[8]，对纤维素的降解能力有限。近年来的研究发现：从自然界中筛选产纤维素酶的菌株后，对其发酵条件进行优化以及对菌株进行诱变或改造，可提高菌株产纤维素酶的能力。文献[9]利用紫外线对出发菌株进行诱变后，获得的绿色木霉菌(Trichodermavride)菌株K6产纤维素酶的酶活性是出发菌株的1.39倍。文献[10]从书虱伴生菌中筛选得到5株产纤维素酶的菌株，分别使用单因素分析法和响应面分析法，对纤维素酶活性最高的S2菌株的产酶发酵条件进行了优化，在优化后的发酵条件下，S2菌株的纤维素酶活力比优化前提高了45%。

文献[11]从土壤中分离得到了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisLY02，B.LY02)，但其在新鲜培养液中的产酶活性最高仅为0.535 1 U/mL。为了提高B.LY02的产酶活性，本文对菌株B.LY02进行了发酵条件的优化，以摸索最佳产酶发酵条件，为其进一步的工业化应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

地衣芽孢杆菌B.LY02由河南科技大学宏翔生物饲料实验室分离保存。

种子培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。

发酵培养基：牛肉膏5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，羧甲基纤维素钠10.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。

发酵产酶培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，羧甲基纤维素钠10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。

3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)试剂：称取200.0 g酒石酸钾钠，溶于一定量水中，加热溶解，添加3,5-二硝基水杨酸10.0 g，氢氧化钠10.0 g，溶解后加入苯酚2.0 g，无水亚硫酸钠0.5 g。全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1 000 mL。用前一周配制。

1.2方法

1.2.1培养基碳源的优化

在发酵产酶培养基中用不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖和淀粉)，质量浓度为10 g/L，按2.0%(体积分数)接种种子液，37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h，离心取上清液。采用3,5-二硝基水杨酸法[5,12]测定上清液中的纤维素酶酶活(下同)，确定培养基的最佳碳源。

1.2.2培养基氮源的优化

在最佳碳源的基础上，培养基中用不同的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和硝酸钾)，质量浓度均为10 g/L，按2.0%(体积分数)接种种子液，37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h，离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定培养基的最佳氮源。

1.2.3接种量的优化

将种子液按体积分数分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%接种于100 mL优化的产酶培养基，于37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h，离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳接种量。

1.2.4摇床转速的优化

取10个250 mL三角瓶，各加入50 mL优化的产酶培养基，按1.2.3筛选的最佳接种量接种，分别于120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min和260 r/min的转速下，37 ℃振荡培养24 h。离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳摇床转速。

1.2.5培养基装液量的优化

取10个250 mL三角瓶，分别加入20 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL和100 mL优化的产酶培养基，按1.2.3筛选的最佳接种量接种，于37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h。离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳装液量。

1.2.6培养温度的优化

采用上述最佳条件，将菌液分别于25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃和46 ℃条件下培养24 h，每瓶取样5 mL,离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最适培养温度。

1.2.7培养时间的优化

采用上述最佳条件，将菌液分别培养12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h，每瓶取样5 mL,离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最适培养时间。

1.2.8培养基初始pH值的优化

取6个200 mL三角瓶，采用上述最佳条件进行配制，将各瓶培养基 pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按照上述最佳条件培养，离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳初始pH值。

1.2.9优化前后酶活对比

采用最佳培养基及最佳发酵条件对B.LY02菌株进行发酵培养，测定纤维素酶酶活，同时以优化前发酵条件为对照，对比优化后和优化前菌株纤维素酶酶活的变化。

2结果与分析

2.1培养基碳源对酶活的影响

在发酵产酶培养基的基础上，研究不同碳源对B.LY02菌株产纤维素酶酶活的影响，结果见表1。由表1可以看出：当以麦芽糖为碳源时酶活最高，而以葡萄糖为碳源时酶活最低。

表1　培养基碳源对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.2培养基氮源对酶活的影响

在发酵产酶培养基的基础上，研究不同氮源对B.LY02菌株产纤维素酶酶活的影响，结果见表2。由表2可以看出：该菌株对有机氮源的利用显著优于无机氮源，其中，以酵母膏为氮源时菌株的酶活最高，其次是蛋白胨和牛肉膏。

表2　培养基氮源对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.3接种量对酶活的影响

不同接种量对菌株产纤维素酶酶活的影响结果见表3。由表3可以看出：在接种量为0.5%～2.0%时，菌株产酶活性基本与接种量呈正相关，随着接种量的增加而增加；接种量为2.0%时酶活最高，然后随着接种量的增加，酶活呈逐渐下降趋势。

表3　接种量对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.4摇床转速对酶活的影响

摇床转速对产纤维素酶酶活的影响结果见表4。由表4可知：转速在180～200 r/min时酶活最高；但当转速超过200 r/min时，酶活呈下降趋势。

表4　摇床转速对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.5培养基装液量对酶活的影响

培养基装液量对产纤维素酶酶活的影响结果见表5。由表5可知：装液量在20～60 mL时，随着装液量的增加，菌株酶活也在增加；在装液量为60 mL时，菌株酶活最大，但超过60 mL后，酶活呈下降趋势。

表5　培养基装液量对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.6培养温度对酶活的影响

使用上述优化后的培养基，在最佳培养条件下，选择不同温度进行摇瓶培养，研究培养温度对菌株产纤维素酶酶活的影响，结果见表6。由表6可知：在37 ℃时酶活最高；当温度低于34 ℃或高于40 ℃时，酶活都会显著下降。

表6　培养温度对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.7培养时间对酶活的影响

在上述优化条件的基础上，研究培养时间对菌株产纤维素酶酶活的影响，结果见表7。由表7可知：当培养至30 h时，粗酶液的酶活最高，并且在24～36 h均可保持较高的酶活；当培养时间低于18 h时，酶活呈直线下降趋势，而高于42 h时酶活则缓慢下降。

表7　培养时间对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.8培养基初始pH值对酶活的影响

分别配制不同初始pH值的培养基，其他条件按照上述最佳条件进行，培养合适时间后，研究初始pH值对菌株产纤维素酶酶活的影响，结果见表8。由表8可知：pH值在5.0时酶活最高；而pH值低于5.0或高于7.0时，纤维素酶酶活均快速下降。

表8　培养基初始pH值对菌株产纤维素酶酶活的影响

2.9优化前后酶活对比

采用优化前和优化后的培养基及培养条件，同时对B.LY02菌株进行发酵培养，测定其产纤维素酶酶活，优化结果显示：优化后所得的纤维素酶酶活可达0.683 5 U/mL，较优化前的0.535 1 U/mL提高了约27.73%。

3讨论

与其他微生物一样，地衣芽孢杆菌所产酶的酶活受培养基和培养条件的影响，如培养基的碳源、氮源、初始pH值、培养温度、时间以及摇床转速等[7，13]。因此，本文主要对这些产酶条件进行了优化。接种量会影响菌株的生长速度，从而影响其代谢产物的水平[14]。接种量的优化结果表明：在接种量高于2.0%时，菌株产酶活性随着接种量的增加呈逐渐下降趋势。这是因为随着接种量的增加，培养基中的营养消耗得太快，增殖的细菌量减少，菌株的产酶活性也随之下降。本文研究结果显示：随着摇床转速的提高，菌株产酶活性也在逐渐增加。这是因为B.LY02菌株是一种完全需氧菌[5]，转速提高，不仅会增加培养基的溶氧量，而且还有利于菌体与培养基的充分均质，以利于菌株的生长，菌株产酶活性自然就增加。但当转速超过200 r/min时，酶活呈下降趋势，这是因为转速过快会加速菌体的裂解，或加速菌株孢子体的形成，从而影响酶的产生。装液量可影响培养液的溶氧量，因此也直接影响菌株的生长速度。装液量少会加速菌株的生长，因此菌株产酶活性增加；装液量过多，影响菌液的溶氧量和上下层培养液的均匀性，从而影响酶的快速产生。因此，在装液量为60 mL时，菌株的产酶活性达到最大，随后产酶活性下降。从研究结果看出：培养温度和pH值对B.LY02菌株产纤维素酶的能力具有较大影响。在最佳pH值和最佳培养温度前后，菌株的产酶活性下降都较快，这与文献[15]试验结果相似。因此，在利用该菌株发酵产纤维素酶时要控制好培养温度，并实时监测和调节培养液的pH值，以最大限度地发挥菌株的产酶潜能。培养时间优化结果表明：B.LY02菌株需要培养到一定时间后，才开始快速分泌纤维素酶，培养36 h以后，菌株产酶活性缓慢下降。这是由于随着培养时间的延长，菌株生长缓慢或停止生长，产酶也随之下降或停止，而已产生的酶可能会被多余的底物消耗或被离子螯合。采用优化后的发酵条件对B.LY02菌株进行培养后，其纤维素酶酶活达0.683 5 U/mL，虽然较出发菌株提高了约27.73%，但其产酶活性还不是很理想，期望通过对菌株进行诱变选育可进一步提高该菌株的产酶活性[16]。

本研究结果表明：按照2.0%的接种量将B. LY02菌株接种至60 mL(250 mL三角瓶)、碳源为麦芽糖、氮源为酵母膏、初始pH值为5.0的发酵产酶培养基中，在37 ℃、转速为180～200 r/min条件下培养30 h，菌株所产纤维素酶酶活达0.683 5 U/mL，较优化前提高了约27.73%。

参考文献：

[1]BHAT M K,BHAT S.Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications[J].Biotechnology advances,1997,15(3):583-620.

[2]REGINA V,ALGIMANTAS P,VITA R.Cellulose degradation in rye straw by micromycetes and their complexes[J].Ekologija,2008,54(1):29-31.

[3]方诩,秦玉琪,李雪芝,等.纤维素酶与木质纤维素生物降解转化的研究进展[J].生物工程学报,2010,26(7):864-869.

[4]潘进权,钟德广.固定化地衣芽孢杆菌产弹性蛋白酶的研究[J].食品科学,2014,23:176-181.

[5]董鹤娟,丁轲,恒子钤,等.一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定[J].家畜生态学报,2013,34(6):48-52.

[6]刘洋,王一琰,白黎婧,等.一株酸性淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究[J].食品工业科技,2014,35(4):174-178.

[7]吴程雨.地衣芽孢杆菌脂肪酶发酵条件优化及固定化研究[D].杭州:浙江理工大学,2015.

[8]LI W,HUAN X J,ZHOU Y,et al.Simultaneous cloning and expression of two cellulase genes fromBacillussubtilisnewly isolated from Golden Takin (BudorcastaxicolorBedfordi)[J].Biochemical and biophysical research communications,2009,383(4):397-400.

[9]屈二军,谢展,马孟星,等.高产纤维素酶的绿色木霉菌种的诱变和筛选[J].农业与生物技术学报,2011,12(10):1411-1412,1416.

[10]郑豪盈,樊永欣,张林,等.书虱伴生菌中纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及最佳产酶发酵条件的优化[J].环境工程学报,2015,9(8):4090-4096.

[11]董鹤娟,丁轲,恒子钤,等.一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定[J].家畜生态学报,2013,34(6):48-52.

[12]罗艳青,张丹,冯海玮,等.DNS法检测灰略红链霉菌JSD-1产纤维素酶的CMC酶活条件的优化[J].食品工业科技,2015,36(3):156-162.

[13]龚劲松,李恒,刘恒霞,等.碳氮源对枯草芽孢杆菌发酵产β-甘露聚糖酶的影响[J].食品与发酵工业,2015,41(10):34-39.

[14]张谦,贾佳,林智,等.产脂肪酶黑曲霉摇瓶发酵条件优化研究[J].生物技术通报,2015,31(12):1-6.

[15]付星,闫巧娟,江正强,等.高产几丁质酶巴伦葛兹类芽孢杆菌的筛选和发酵条件优化[J].微生物学通报,2015,42(4):625-633.

[16]方芳,李相前,赵玉萍,等.紫外-微波复合诱变选育高产纤维素酶的Trichodermaasperelloides菌株[J].中国饲料,2015(2):27-30.

基金项目：河南省科技厅重大科技攻关基金项目(131100110300)；河南省教育厅重点基金项目(13B230987)

作者简介：余祖华(1977-)，女，河南商城人，讲师，博士，主要从事动物微生态学和动物免疫学方面的研究.

收稿日期：2016-01-24

文章编号：1672-6871(2016)04-0076-05

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.04.016

中图分类号：S816.3

文献标志码：A