禽腺病毒4型PCR检测方法的建立与应用

袁万哲，张 姗，陈 萍，张 超，经 美，崔 元，孙继国，刘聚祥（. 河北农业大学动物医学院，河北保定 0700；2. 河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定 0700；.石家庄市兽用生物制品供应站，河北石家庄 050000）



禽腺病毒4型PCR检测方法的建立与应用

袁万哲1，2，张 姗1，陈 萍1，2，张 超3，经 美1，2，崔 元1，2，孙继国1，2，刘聚祥1，2
（1. 河北农业大学动物医学院，河北保定 071001；
2. 河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定 071001；
3.石家庄市兽用生物制品供应站，河北石家庄 050000）

摘 要：根据禽腺病毒4型（FAdV-4）Hexon基因核苷酸序列，设计用于扩增FAdV-4的PCR引物，建立了FAdV-4 PCR检测方法。特异性和敏感性实验结果表明，该方法可扩增出954 bp的特异性核酸片段，而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒与禽腺病毒11型的检测结果均为阴性，对FAdV-4的最低核酸检出量为12.9 pg。该方法可用于禽腺病毒4型的临床检测与流行病学调查。

关键词：禽腺病毒4型；PCR；检测

2015年6月以来，我国多数省份的鸡群发生了以心包积液、肝脏肿大为特征的疾病。该病主要发生于20～30日龄的肉鸡，发病后4～8天为死亡高峰，病程为8～15天，死亡率达20%～30%。同时20～70日龄以及200～300日龄的蛋鸡也有发生，但死亡率低于肉鸡。通过病原分离鉴定和动物回归试验，本项目组最终确定该病的病原为禽腺病毒4型（fowl adenovirus 4，FAdV-4）[1-2]。目前，该病仍有发生与流行，给我国养鸡业造成了一定的经济损失。

正确、快速诊断是科学防控禽腺病毒4型的前提与基础。聚合酶链式反应（PCR）由于特异性好、灵敏性高、重复性好等优点，在动物疫病检测领域被广泛应用。目前国内尚无检测禽腺病毒4型的PCR检测试剂盒及检测方法。本项目组建立了禽腺病毒4型PCR检测方法，并对2015年以来我国FAdV-4的流行情况进行了监测。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株。新城疫病毒与H9亚型禽流感病毒（avian infl uenza virus，AIV）血凝抑制试验抗原购自哈尔滨维科生物技术开发有限公司；传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）与禽腺病毒11型（fowl adenovirus 11，FAdV-11）由本实验室保存。

1.1.2试剂。病毒核酸提取试剂盒、dNTPs、2×Taq PCR Mix、M-MLV酶和DNA Marker DL2000均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2引物设计

根据GenBank登录的FAdV-4（GenBank ：GU188428.1）Hexon基因核苷酸序列，设计用于扩增FAdV-4的PCR引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，具体见表1。

表1　禽腺病毒4型PCR检测引物

1.3病毒核酸提取

根据病毒核酸提取试剂盒说明书操作，简述如下：加入20 μL Proteinase K于1.5 mL离心管中；在离心管中加入200 μL样品，加入200 μL BB5，涡旋混合15 s，56 ℃孵育15 min；加入250 uL无水乙醇，涡旋混合15 s，室温放置5 min；将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12 000 ×g离心1 min，弃掉流出液。加入500 μL WB5，12 000 ×g离心1 min，弃掉流出液，重复一次。室温12 000 ×g离心1 min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱；将离心柱转入1.5 mL离心管中，并向离心柱中央加20 μL RNase-free Water，室温静置1 min。室温12 000 ×g离心1 min，洗脱DNA/RNA，-20 ℃贮存备用。

1.4PCR

取反转录得到的产物cDNA或提取的DNA，进行PCR鉴定。在25 μL体系里，按照比例加入cDNA/DNA 2 μL、2×TaqPCR Mix 12.5 μL、引物（10 uM）各0.5 μL和dd H2O 9.5 μL。94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸57 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。同时设立阴性对照。PCR结束后，取5 μL PCR扩增产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.1特异性检测。提取FAdV-4、AIV、NDV、IBV与FAdV-11核酸，按照如上方法进行PCR，检测该方法的特异性。其中AIV、NDV、IBV核酸先利用反转录引物进行反转录。在20 μL体系里，依次加入RNA 11 μL、5×RT Buffer 4 μL、FAdV-4-decR（10 uM）2 μL、dNTP Mixture（2.5 mM）2 μL、RNasin（30 U/μL）、0.5 μL和M-MLV酶（2.5 U/μL）0.5 μL，42 ℃反转录 1 h，得到的产物为cDNA。

1.4.2敏感性检测。对提取的病毒核酸用超微量分光光度计测定浓度后，对经10倍系列稀释的病毒核酸用以上反应体系和程序进行PCR反应。反应结束后，取等量 PCR扩增产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.5临床检测

应用建立的PCR方法，对山东、河北、河南、安徽、山西等地送检的30份临床样本进行检测。

2　结果

2.1PCR产物鉴定

按照优化的PCR反应体系与条件，进行FAdV-4扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物。FAdV-4阳性样本扩增产物条带大小为954 bp（图1）。回收PCR产物，经连接转化后测序证实，扩增产物均为FAdV-4特异性核酸片段。

2.2PCR特异性检测

特异性实验结果表明，含有FAdV-4的核酸样品能扩增出与预期大小相符的954 bp条带，而禽流感病毒、禽腺病毒11型、传染性支气管炎病毒与新城疫病毒均未扩增出任何条带，说明该方法具有较好的特异性（图2）。

2.3PCR敏感性检测

用超微量分光光度计测得FAdV-4核酸浓度为129.3 ng/μL。应用优化后的PCR方法对10倍稀释的FAdV-4核酸模板进行检测，结果表明，该PCR最低能检测到12.9 pg/μL核酸模板（图3）。

图1　禽腺病毒4型PCR检测

图2　PCR特异性检测

图3　PCR敏感性检测

2.4临床检测

应用30份临床送检样本分别用建立的PCR方法进行检测，21份临床样本为FAdV-4阳性，其中山东、河北、山西、河南等地均有检出。

3　讨论

2015年6月以来，我国山东、河南、河北、辽宁、安徽、吉林等地区的鸡群发生了以心包积液、肝脏肿大为特征的疾病。根据病变，该病被称为“鸡心包积液-肝炎综合征”。该病主要发生于20～30日龄的肉鸡，同时20～70日龄以及200～300日龄的蛋鸡也有发生，但死亡率低于肉鸡。临床病例最早可见7日龄的雏鸡发病。鸡死亡前均正常采食，无明显临床表现而倒地死亡。目前，该病的发病区域还在不断扩大，给我国养鸡业造成了一定的经济损失。现已证实，该病的病原为禽腺病毒4型。该病最早于1987年在巴基斯坦卡拉奇市附近的安卡拉地区发生，故也称为安卡拉病[3]。我国之前尚未见该病大面积发生与流行的报道。

禽腺病毒4型临床表现与鸡包涵体肝炎等容易混淆，而且感染后期易继发禽流感、大肠杆菌等，通过临床观察与剖检手段很难确诊，需要采用实验室手段进行诊断。传统的病毒分离普遍具有操作繁琐、时间长以及敏感性差等缺点。PCR由于特异性好、灵敏性高等优点，在动物疫病检测领域被广泛应用。目前国内尚无检测禽腺病毒4型的PCR检测试剂盒及检测方法。

本研究首次应用PCR 技术针对禽腺病毒4型Hexon基因进行检测，建立了一种快速、敏感、特异的FAdV-4检测方法。该方法最低能检测12.9 pg/μL FAdV-4 核酸模板，可用于禽腺病毒4型的临床监测与流行病学调查。对2015年至2016年的30份临床送检样本分别用PCR进行检测，发现21份临床样本为FAdV-4阳性，检出率比较高的是肝脏与脾脏样品，肺脏与肾脏的样品中偶有检出，因此建议临床发病后可采集肝脏与脾脏检测。在临床送检样本中，最早发病的为7日龄海兰灰蛋鸡，临床表现为典型的心包积液与肝炎，肝脏与脾脏中均有FAdV-4被检出。该鸡是水平感染的还是垂直感染的，有待进一步研究。

参考文献：

[1] 袁万哲，李玉保，王建昌，等. 鸡心包积液-肝炎综合征的初步研究[J]. 中国兽医科学，2016，46（2）：157-160.

[2] 袁万哲. 科学防控鸡心包积液—肝炎综合征[J]. 中国动物保健，2016，18（2）：35-35.

[3] 扈荣良. 现代动物病毒学[M]. 北京：中国农业出版社，2014，681-683.

（责任编辑：朱迪国）

Development and Application of PCR Assay for Detection on Fowl Adenovirus 4

Yuan Wanzhe1，2，Zhan Shan1，Chen Ping1，2，Zhang Chao3，Jing Mei1，2，Cui Yuan1，2，Sun Jiguo1，2，Liu Juxiang1，2
（1. College of Animal Medicine，Agriculture University of Hebei，Baoding，Hebei 071001；
2. Hebei Engineering and Technology Research Center of Veterinary Biotechnology，Baoding，Hebei 071001；3. Shijiazhuang Animal biological Products Supply Station，Shijiazhuang，Hebi 050000）

Abstract：According to Hexon gene sequence of fowl adenovirus 4（FAdV-4）published in GenBank，one pair of specifi c primers was designed for amplifying the specifi c fragments. PCR assay was developed for detection of FAdV-4. The sensitivity and specifi city detections suggested that the PCR assay was so sensitive that it could detect the 12.9 pg level. Specifi c PCR products of 954bp could be amplifi ed by the PCR assay. But the detection results for avian infl uenza virus，newcastle disease virus，infectious bronchitis virus and fowl adenovirus 11 by the PCR assays were all negative. The PCR assay developed in this study can be applied widely in clinical diagnosis and fi eld surveillance of FAdV-4 infection.

Key words：fowl adenovirus 4（FAdV-4）；PCR；detection

中图分类号：S852.65

文献标志码：A

文章编号：1005-944X（2016）05-0072-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.023

基金项目：河北省现代农业产业技术体系蛋鸡产业创新团队专项资金；正定县科学技术研究与发展计划项目