乳腺癌肿大腋窝淋巴结中BCSCs相关基因表达与肿瘤复发、转移的关系

余天雾,龚建平,郭　丹,周　健

(1.重庆医科大学附属永川医院普外3科　402160;2.重庆医科大学附属第二临床学院肝胆外科　400010;3.重庆医科大学附属第二临床学院三腺外科　400010)



乳腺癌肿大腋窝淋巴结中BCSCs相关基因表达与肿瘤复发、转移的关系

余天雾1,龚建平2△,郭丹3,周健1

(1.重庆医科大学附属永川医院普外3科402160;2.重庆医科大学附属第二临床学院肝胆外科400010;3.重庆医科大学附属第二临床学院三腺外科400010)

[摘要]目的探索乳腺癌干细胞(BCSCs)相关基因 CD44、Twist1、OCT4在乳腺癌患者癌组织、腋窝肿大淋巴结中的表达与乳腺癌转移及复发的关系。方法以免疫组化法和组织免疫荧光聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测乳腺癌患者癌组织、腋窝淋巴结中BCSCs相关因子CD44、CD24、Twist1和OCT4的基因和抗原表达。结果在术前和术中确诊为乳腺癌的14例患者中均有癌细胞腋窝淋巴结转移。免疫组化法测得乳腺癌癌组织、腋窝肿大淋巴结BCSCs相关因子CD44、Twist1和OCT4抗原阳性过表达，而CD24呈低表达；RT-PCR检测乳腺癌组织、腋窝淋巴结中BCSCs相关因子CD44、Twist1和OCT4的基因表达增强(P<0.05)，CD24基因低表达(P>0.05)。结论乳腺癌伴腋窝淋巴结肿大者BCSCs相关因子CD44、Twist1和OCT4的基因、抗原表达明显增高，可能表明BCSCs相关因子与乳腺癌细胞易早期转移、复发有关。

[关键词]乳腺肿瘤；干细胞；CD44；Twist1；OCT4

乳腺癌标本或乳腺肿瘤细胞系中乳腺癌干细胞(BCSCs)的鉴别主要是基于肿瘤细胞表面的分子表型如CD44+CD24-/low或ALDH+。除了CD44，与肿瘤的侵袭、转移和复发有关的因素还包括BCSCs 的其他相关基因的过表达，如OCT4和Twist1。在肿瘤细胞中或表达OCT4的细胞株中像肿瘤干细胞样的细胞只是很少的一部分，它是转录因子POU家族中的一个，在胚胎干细胞中维持多能和增殖的作用。正常乳腺组织的OCT4的过度转导作用导致拥有诱发肿瘤和肿瘤侵袭能力的细胞系产生。临床研究表明，与低级别和OCT4低表达的肿瘤相比，肿瘤干细胞分子OCT4过表达的乳腺肿瘤与病情进一步恶化、远处转移和生存期更短密切相关[1]。具有螺旋-环-螺旋基础结构的转录因子Twist1已被报道在肿瘤细胞血液播散、转移方面有强大的促进作用，也为临床的研究、有效的治疗干预提供了理想的标靶。Twist1能促使细胞的表皮间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，能使癌细胞之间失去细胞黏附和肿瘤细胞转移[2]。对于上皮恶性肿瘤来说，EMT是癌细胞血液播散的关键事件[3]，同时认为它有助于肿瘤干细胞分子表型的形成[4]。尤其是EMT促进了癌细胞从原发灶脱离并且通过丧失细胞极性和黏附能力来促进癌细胞的迁徙[5]。进一步阐明Twist1促进肿瘤转移的机制和Twist1功能调节子的识别有助于制订出抑制EMT和肿瘤转移的新策略。乳腺癌淋巴结转移(lymph nodes metastasis,LNM)表明淋巴结内含有侵袭力强的分子表型的癌细胞而且EMT调节子的水平表达上调[6]。试验模型提供的证据进一步解释了原发肿瘤具有发展到肿瘤细胞播散和促进生长因子表达增加的可能。因而，LNM可以作为原发性乳腺肿瘤侵袭和远处转移潜能的替代性分子标志[6]。目前BCSCs在乳腺癌患者腋窝淋巴结、血液循环和骨髓存在情况与乳腺癌转移的关系所知甚少，而且缺乏有效的检测方法。本课题拟以BCSCs为细胞平台，CD44、Twist1、OCT4干细胞基因表达为BCSCs检测依据，以免疫荧光聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD44、Twist1、OCT4干细胞基因的表达，初步探索BCSCs与乳腺癌复发和转移的相关性。

1材料与方法

1.1材料本研究选取14例2013年乳腺癌术后患者，病理诊断明确。14例均为女性，年龄38～69岁，中位年龄53.5岁。本院乳腺癌患者术中切下的乳腺癌组织、肿大腋窝淋巴结(14例)均经病理检查结果证实；所有这些操作均遵守科学实验伦理道德委员会管理章程。

1.2试剂抗体CD44、CD24、Twist1、OCT4购于Santa公司，RT-PCR试剂盒、CD44、CD24、Twist1及OCT4 primer购于TakaRa公司；免疫荧光二抗抗体(驴抗兔IgG-FITC和羊抗兔PE抗体购于SA (USA)公司；磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)购于南京生物试剂公司。

1.3方法

1.3.1免疫荧光和激光共聚焦操作过程将手术中取下的乳腺癌灶组织、腋窝淋巴结、正常乳腺组织进行脱水、冰冻切片固后定于载玻片。PBS浸洗切片3 min后滴加3% H2O2及山羊血清封闭组织，在湿盒中37 ℃封闭15 min(室温30 min也可)。再滴加CD44抗体(以0.01 mol/L，pH7.4的PBS稀释1∶100)覆盖标本切片。置湿盒中4 ℃孵育过夜(37 ℃ 1～2 h许)，再用PBS浸洗3 min，重复5次，洗去一抗后滤纸擦去标本液体。滴加荧光二抗置湿盒中，37 ℃避光孵育1 h，再以PBS浸洗3 min，反复5次洗去二抗。以50%甘油封片后立即在荧光显微镜下观察。以同样方法操作CD24、Twist1、OCT4免疫荧光激光共聚焦检查。

1.3.2RT-PCR检测乳腺癌灶组织、腋窝淋巴结、正常乳腺组织CD44、CD24、Twist1、OCT4的基因表达先以超声波碎掉冰冻的乳腺组织、乳腺癌组织和腋窝淋巴结。再用Trizol提取总RNA，紫外分光光度计检测质量与含量。采用TaKaRa公司反转录试剂盒，严格按照试剂盒操作说明反转录获得cDNA。CD44:5′-GCC CAA TGC CTT TGA TGG ACC-3′ (Sense primer),3′-GCA GGG ATT CTG TCT GTG CTG-5′ (Anti-sense primer);CD24:5′-ATG GGC AGA GCA ATG GTG GCC A-3′(Sense primer),3′-TCA AGA GAA GCA CCA GAG TGA GA-5′ (Anti-sense primer);Twist1:5′-CAA GAA GTC TGC GGG CTG TG-3′(Sense primer),5′-TCG TTC AGC GAC TGG GTG C-3′(Anti-sense primer);OCT4:5′-CAA ACG ACC ATC TGC CGC T-3′(Sense primer),5′-CAG GTT GCC TCT CAC TCG GTT-3′(Anti-sense primer)。退火条件：56 ℃。常规PCR 操作，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，Alpha Innotech Coporation凝胶成像系统观察并拍照。

2结果

2.1临床病理资料本研究共收集了14例原发性侵袭性乳腺癌患者，每例肿瘤标本均经有经验的病理医生确认，每例患者均经国际抗癌协会TNM标准分级。乳腺肿瘤小于或等于2 cm占42.8%(6例)，肿瘤大于2 cm占57.2% (8例)。根据Elston和 Ellis方法将肿瘤标本行组织学分级：1～2级占42.8%(6例)，3级占57.2%(8例)；在所有肿瘤标本中11例为侵袭性导管癌(IDC)，而其余的3例为髓样癌或乳腺小叶癌。为了便于分析资料，笔者还收集了患者标本的部分免疫组化指标如孕激素受体(PR)、雌激素受体(ER)、人表皮生长因子受体-2(HER2)、CEA和BCA225。当10%的细胞核阳性表达时判定为PR或ER过表达。根据Herceptest评分系统使用单克隆抗体对HER2进行评分。0：无细胞膜反应或不足10%细胞有反应；1：超过10%细胞存在不全性细胞膜反应；2：超过10%细胞有弱至中等强度的完全包膜反应；3：超过10%细胞强烈的完全包膜反应。14例中有12例BCA225血清抗原高于75 μg/L，2例血清抗原低于75 μg/L。有11例患者CEA血清抗原高于7 ng/L，3例患者CEA血清抗原低于7 ng/L。

A：正常乳腺组织中的CD44抗原；B：乳腺癌组织中的CD44抗原；C：转移淋巴结中的CD44抗原；D、E：RT-PCR检测。

图1CD44 在邻近正常的乳腺组织、乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结中的表达

A：正常乳腺组织中的CD24抗原；B：乳腺癌组织中的CD24抗原；C：转移淋巴结中的CD24抗原；D、E：RT-PCR检测。

图2CD24在邻近正常的乳腺组织、乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结中的表达

A：正常乳腺组织中的OCT4；B：乳腺癌组织中的OCT4；C：转移淋巴结中的OCT4；D、E：RT-PCR检测。

图3OCT4 在邻近正常的乳腺组织、乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结中的表达

2.2CD44、CD24抗体检测遂行组织冰冻切片CD44和CD24抗体染色、激光共聚焦检测。激光共聚焦扫描显示：CD44抗原尽管也表达于正常乳腺组织(图1A)，但主要存在于肿瘤细胞膜上，细胞间质内也有少量表达；乳腺癌组织(图1B)和转移淋巴结中(图1C)CD44的表达要明显强于邻近正常的乳腺组织。RT-PCR检测结果显示:在乳腺癌组织和转移淋巴结中CD44基因表达均明显强于邻近正常的乳腺组织(图1D、E)，而CD44在肿瘤组织和转移淋巴结中的过表达。RT-PCR结果显示乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结中的CD44 mRNA 表达明显强于邻近正常的乳腺组织(P<0.05)，在乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。CD24在正常乳腺组织、原发癌灶内和淋巴结中皆少量表达或不表达(图2)，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3OCT4检测原发乳腺癌组织和转移淋巴结中的OCT4具有自我更新和促使癌细胞增殖的功能，OCT4抗原主要表达于肿瘤细胞膜上和细胞基质内；它可表达于正常乳腺组织上皮细胞核内(图3A)，乳腺癌组织(图3B)和转移的腋窝淋巴结中(图3C)，明显强于邻近正常的乳腺组织(图3A)。RT-PCR结果显示:在乳腺癌组织和转移淋巴结中OCT4基因表达均明显强于正常的乳腺组织(图3D、E)。RT-PCR检测，乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结中的OCT4 mRNA 表达明显强于邻近正常的乳腺组织(P<0.05)， 在乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

A：正常乳腺组织中的Twist1；B：乳腺癌组织中的Twist1；C：转移淋巴结中的Twist1；D、E：RT-PCR检测。

图4Twist1在邻近正常的乳腺组织、乳腺癌组织和转移的腋窝淋巴结中的表达

2.4Twist1检测原发性乳腺癌和淋巴结转移灶中Twist1的过表达可能有助于癌细胞的迁徙、侵袭和远处转移分别以激光共聚焦、RT-PCR对3种组织中的Twist1的表达状态进行了检测。激光共聚焦照片显示：乳腺导管癌上皮的基底层的细胞核内和细胞间质内，而且正常乳腺组织内小管上皮基底层的细胞核内也可见少量表达(图4A)。然而正常乳腺组织Twist1较原发乳腺癌组织(图4B)和转移的腋窝淋巴结组织(图4C)的荧光强度弱得多。RT-PCR检测结果显示乳腺癌组织和转移腋窝淋巴结中Twist1基因的表达较正常乳腺组织中的表达要强很多(图4D、E)，差异有统计学意义(P<0.05)，然而在后二者中差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

3.1乳腺癌组织和腋窝淋巴结中BCSCs分子标志物CD44的高表达是癌细胞增殖、转移的关键环节第1个被确认的实体肿瘤干细胞来源于乳腺癌，那些具有CD44+CD24-标志物的一小撮细胞亚群(仅100个那样少)能再生为一个肿瘤实体，反之，不具有这种生物标志的众多肿瘤细胞却具有该功能[7]。试验结果表明CD44分子在原发乳腺癌和转移的腋窝淋巴结中高表达而在正常乳腺组织中低表达。而CD24在肿瘤组织、腋窝淋巴结和正常组织中均低表达，这与以前的研究相符合。Li等[8]报道到了乳腺癌肿瘤干细胞是由高水平的透明质酸受体CD44和对热稳定的低表达的CD24分子为特征的细胞。这表明乳腺癌干细胞主要在形成的初始阶段其主要作用并维持这种趋势。乳腺癌干细胞CD44+CD24-也保持干细胞的多种特性如自我更新、增殖和促进癌细胞转移等。进一步研究表明，以透明质酸诱导为基础的这类肿瘤细胞的标志包括高聚集的CD44+CD24-为特征的肿瘤侵袭性细胞，细胞连接蛋白如钙黏素和封闭素下调，以及丰富的表皮间质化标志物如强烈的淋巴细胞侵袭和对化疗产生抵制的分子表型过表达[9]。因而以CD44为标靶可以干预乳腺癌干细胞的分化、自我更新和肿瘤的侵袭。

3.2乳腺癌干细胞OCT4的高表达维系了癌细胞的自我更新并增加了对治疗的抵制和复发的概率正常组织中的OCT4，尤其是孕期，具有多重功能如乳腺上皮细胞的自我更新、增殖，以及环境诱导的多重特性[10-11]。正常乳腺组织中OCT4一旦变异，他的转导就会导致具有侵袭、克隆能力的肿瘤细胞系产生。实验结果表明和正常组织相比，乳腺组织和受累腋窝淋巴结内OCT4的基因和蛋白均为过表达。这表明OCT4与细胞的产生和分化状态密切相关。而且当正常组织内OCT4呈高表达时赋予了肿瘤发生的能力。临床研究已表明：与组织内OCT4呈中低程度表达相比，COT4干性分子高表达的肿瘤与疾病进展、远处转移和远期更短的生存期有关[1]。OCT4预后差与肿瘤干细胞耐药增多导致肿瘤患者化疗失败率高有密切关系[12]。

CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞中Twist1的过表达由于使上皮间质化而促进了肿瘤的侵袭转移。尽管Twist1在其他上皮类肿瘤细胞的核内表达是低频率事件，但是在乳腺癌细胞核内表达却具有重要的临床意义。试验结果显示Twist1主要表达在乳腺癌和转移淋巴结中CD44+CD24-/low癌细胞核内,同时正常组织内也有少量表达。这表明Twist1可能主要在肿瘤的起始和促进肿瘤转移方面起作用。更重要的是，笔者发现在Ⅰ～Ⅳ级的乳腺癌组织和腋窝淋巴结内发现Twist1的表达上调。表明转移淋巴结内Twist的高表达及后者从阴性到阳性的转变可能会导致更差的预后。研究证明乳腺上皮中Twist1可能通过CD44的过表达促进乳腺癌干细胞的产生和醛酸脱氢酶活性的增加使上皮间质化[8，13]。另一方面，Twist1诱导了上皮间质化,能使上皮肿瘤细胞具有间质化细胞系的特性如与癌细胞远处转移密切相关的迁徙和侵袭能力[14]。本研究和文献报道表明肿瘤间质中的Twist1与肿瘤中阳性ER和PR的状态紧密相关。所有Twist1高表达的肿瘤细胞株都显示了ER基因和蛋白的表达，以及二者在乳腺癌患者中呈反比关系[15]。

本研究发现原发性乳腺癌和转移性腋窝淋巴结中的CD44、OCT4及Twist1分别较正常乳腺组织高表达，而且在Twist1高表达患者中ER呈低表达，预示了这类患者可能预后更差。

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Relation between expression of BCSCs associated genes from swelling axillary lymph nodes of breast cancer with recurrence and metastasis of tumor

Yu Tianwu1,Gong Jianping2△,Guo Dan3,Zhou Jian1

(1.Third Department of General Surgery,Affiliated Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 402160,China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China；3.Department of Three Glands Surgery, Affiliated Second Clinical College,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the relation between the expression of breast cancer stem cells(BCSCs) related gene CD44,OCT4 and Twist1 in breast cancer tissues and swelling axillary lymph nodes with the recurrence and metastasis of breast cancer.MethodsThe genes and antigen expressions of BCSCs relative factors CD44,CD24,OCT4 and Twist1 in th breast cancer tissue and axillary lymph nodes were detected by the immunohistochemical method and RT-PCR.ResultsTotally 14 cases of preoperatively and intraoperatively diagnosed breast cancer had axillary lymph nodes metastasis of cancer cells.The over expression of BCSCs relative factors CD44,OCT4 and Twist1 antigen positive in the breast cancer tissue and axillary lymph nodes were detected by the immunohistochemical method,while CD24 was lowly expressed;the gene expressions of BCSCs relative factors CD44,OCT4 and Twist1 in the breast cancer tissue and axillary lymph nodes were enhanced by the RT-PCR detection (P<0.05),while CD24 gene was lowly expressed(P>0.05).ConclusionThe genes and antigen expression of BCSCs related factors CD44,OCT4 and Twist1 in the patients with breast cancer complicating swelling axillary lymph nodes are significantly increased,which might indicate that the BCSCs related factors are related with easily early metastasis and recurrence of breast cancer cells.

[Key words]breast neoplasms;stem cell;CD44；Twist1；OCT4

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.022

作者简介：余天雾(1968―)，学士，主治医师，主要从事乳腺肿瘤治疗研究。△通讯作者，E-mail:674079699@qq.com。

[中图分类号]R737.9

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)09-1224-05

(收稿日期：2015-09-29修回日期：2015-12-01)