见血清总生物碱提取工艺的优化

李国平，王钰蓉，郑诗雪，庄欢欢

（武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）



见血清总生物碱提取工艺的优化

李国平，王钰蓉，郑诗雪，庄欢欢

（武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）

摘要：利用加热回流法提取见血清总生物碱，以生物碱含量为考察指标，通过单因素试验考察料液比、提取温度、提取时间和乙醇体积分数4个因素对总生物碱提取率的影响，并通过正交试验设计确定提取见血清总生物碱的最佳工艺参数，结果表明：见血清生物碱的最佳提取工艺条件为料液比1∶25，提取温度90℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数50%；在此工艺条件下，见血清总生物碱的含量达到2.34%。

关键词：生物碱；见血清；正交试验；加热回流法；提取率

见血清（Liparis nervosa）属于兰科羊耳蒜属，为地生或者附生草本，分布于福建、江西、浙江、湖南、台湾、广东、广西及西南地区［1］。全草含生物碱，味苦、性凉，有凉血止血、清热解毒的功效［2-3］。有关见血清的研究尚不多，主要集中在见血清的生药鉴定［4］、质量标准［5］、化学成分［6-7］和药理作用［8-9］等。赵颖等［10］通过色谱法确定见血清生物碱为吡咯里西啶类生物碱，董艳芳等［11］的研究表明见血青总生物碱具有较强的抑菌活性和抗氧化性，宋芹等［12］对见血清的止血作用进行了科学评价，认为见血清止血活性突出，是亟待开发的止血新药资源。见血清的止血效果与其生物碱含量相关，如何高效提取其总生物碱且保持生物碱的特性及品质对于该药材的综合开发利用具有重要的意义。文旭等［13］曾利用超声波辅助法研究了见血清生物碱的提取工艺，本文应用常规加热回流法，通过单因素试验和正交试验设计筛选出最佳的提取工艺条件，为见血清止血药的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

药材：见血清全草，采自福建武夷山山区，洗净后自然风干，再放入烘箱中于65℃下烘干48 h，粉碎，过0.5 mm筛备用。

主要试剂：苦参碱标准品、无水甲醇、乙酸乙酯、95%乙醇、盐酸、氨水等均为分析纯。

主要仪器：UV-3000紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）、R205B旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）、pH-100精密酸度计（长沙科仪仪器设备有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 生物碱的提取

称取5 g预处理好的药材至圆底烧瓶中，置于加热回流提取器中，按照单因素试验和正交试验中设置的不同条件分别进行提取，将乙醇提取液旋转蒸发得浸膏。向该浸膏中加入100 mL，0.6 moL/L盐酸，振荡溶解，使其充分反应30 min，过滤；滤液用氨水调到pH=11，用100 mL乙酸乙酯分2次萃取。再用旋转蒸发仪蒸发，萃取液浓缩蒸干后，用无水甲醇定容至25 mL，用移液枪精密吸取50 μL到10 mL容量瓶中，用无水甲醇定容至10 mL备用。

1.2.2 生物碱定量测定

见血清中生物碱属于吡咯里西啶类的化合物，目前尚无见血清生物碱标准品，故本研究选择苦参碱标准品作为对照品。经对苦参碱标准溶液进行全波长扫描，表明在波长220 nm处吸收值最大，故选择220 nm为测定波长。精确称取苦参碱标准品3.20 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，稍稍振动使其溶解均匀，得到质量浓度为0.128 mg/mL的储备液；取储备液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中配制成质量浓度为0.012 8、0.025 6、0.038 4、0.051 2、0.064 0 mg/mL的梯度溶液，在波长220 nm下测定吸光值，作吸光度（y）对浓度（x）的标准曲线图（图1），得到回归方程为y=0.03x-0.000 4，表明苦参碱标准品在质量浓度为0.013 0～0.065 0 mg/mL的范围内与其吸光度呈良好的线性关系。

图1 见血清生物碱的标准曲线

按1.2.1 制备见血清提取液并测定吸光度，根据下式计算见血清总生物碱的含量（mg/g）。

式中：A为吸光度；m为见血清干粉质量。

1.2.3 生物碱提取工艺的优化

1.2.3.1 单因素试验

试验选择料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数这4个单因素，考察各因素不同水平（如表1）对见血清总生物碱含量的影响，每次试验均重复3次。

表1 单因素试验因素水平表

1.2.3.2 正交试验

根据单因素试验结果，分别选取较优因素水平，设计L9（34）正交试验，进一步考察料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数对见血清总生物碱含量的影响，以此优化其提取工艺。选取因素水平如表2。

表2 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 料液比对见血清总生物碱提取含量的影响

在提取温度60℃、提取时间1.0 h、乙醇体积分数70%的条件下，不同料液比对见血清总生物碱提取含量的影响如图2。由图2可知，总生物碱含量随料液比值的升高而逐步提高，料液比为1∶25时，总生物碱含量达最高，当料液比大于1∶25时，总生物碱含量趋于降低。考虑到过高的提取料液比会增加后续操作的难度，且造成试剂浪费，因此，选择料液比1∶15、1∶20、1∶25作为正交试验中的料液比的3个水平。

图2 料液比对总生物碱提取效果的影响

2.2 提取温度对总生物碱提取含量的影响

在料液比1∶15、提取时间1.0 h、乙醇体积分数70%的条件下，不同提取温度对总生物碱提取含量的影响如图3。如图3所示，当提取温度为40～60℃时，总生物碱的提取含量变化曲线趋于平缓，提取得率不高。当提取温度达到70℃时，总生物碱的提取含量达到最高，超过70℃后，总生物碱提取含量迅速降低但高于40～50℃时的提取得率。因过高的温度会致使乙醇挥发速度加快，影响见血清总生物碱的溶出效果；此外，温度过高，总生物碱不稳定，容易分解，影响见血清总生物碱的提取含量。故选用70、80、90℃作为正交试验中提取温度的3个水平。

图3 提取温度对总生物碱提取效果的影响

2.3 提取时间对总生物碱提取含量的影响

在实验条件为料液比1∶15、提取温度60℃、乙醇体积分数70%时，不同提取时间对总生物碱提取含量的影响如图4。由图4可知，随着提取时间的延长，见血清总生物碱的提取含量逐渐增加；当提取时间超过2.0 h后，总生物碱的提取含量开始降低。这可能是由于提取时间过长，杂质的浸出量也增加，从而影响生物碱的提取效果，因此，在正交试验中选用1.5、2.0、2.5 h作为提取时间的3个水平。

图4 提取时间对总生物碱提取效果的影响

2.4 乙醇体积分数对总生物碱提取含量的影响

在实验条件为料液比1∶15，提取温度60℃，提取时间1.0 h时，不同提取时间对总生物碱提取含量的影响如图5。如图5所示，当乙醇体积分数为50%时，总生物碱的提取含量为最高；随着乙醇体积分数的进一步升高，总生物碱的提取含量降低。这可能是因为随着乙醇体积分数的增大，一些醇溶性杂质的溶出量也增加，从而影响了生物碱的提取，因此，选择乙醇体积分数40%、50%、60%作为正交试验中的3个水平。

图5 乙醇体积分数对总生物碱提取效果的影响

2.5 最佳提取工艺的优化

以料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数作为考察因素，根据单因素试验结果，设计L9（34）正交试验，对见血清总生物碱提取工艺进行优化，结果如表3。

表3 正交试验设计结果

极差分析结果表明：对见血清总生物碱提取含量影响最大的因素是提取时间，其次为提取过程中的料液比、乙醇体积分数、提取温度。由此可确定最佳的提取工艺条件为A3B3C3D2，即料液比1∶25，提取温度90℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数50%。在此条件下做验证试验，见血清总生物碱含量为2.34%。

3 结论

见血清是武夷山地区道地药材，品质佳，药效确切，其药用价值与其总生物碱含量密切相关。本研究以乙醇为提取剂，采用加热回流的方法提取见血清总生物碱，通过单因素试验考察对料液比、提取温度、提取时间和乙醇体积分数这4个因素对见血清总生物碱提取含量的影响，再通过正交试验设计筛选出提取见血清总生物碱的最优工艺条件为：料液比1∶25，提取温度90℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数50%，在此条件下提取见血清总生物碱，含量达2.34%。该提取工艺操作过程简单，设备成本低，工艺成熟度高，有一定的应用前景，可为见血清生物碱的开发利用提供科学依据。

参考文献：

［1］国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1999.

［2］王旭红，余过奠.中国兰科药用植物［J］.中国野生植物资源，1993（4）∶15.

［3］周继铭，刘常五，冉崇行，等.复方见血清外用止血药的初步研究［J］.中国医院药学杂志，1983，3（3）∶101-103.

［4］罗红.见血清的显微鉴定［J］.中国伤残医学，2013，21（2）∶122-124.

［5］侯杰荣.见血清质量标准研究［D］.泸州：泸州医学院，2012.

［6］赵颖，胡少南，王昌华，等.兰科药用植物见血青乙酸乙酯部位化学成分研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（22）∶111-113.

［7］赵颖，胡少南，王昌华，等.见血青化学成分研究［J］.中草药，2013，44（21）∶2955-2959.

［8］董艳芳，陈法志，郭彩霞，等.见血青多糖的抑菌活性与抗氧化性［J］.湖北农业科学，2012，51（12）∶2570-2573.

［9］赵颖，胡少南，郑一敏，等.见血青提取物止血作用的实验研究［J］.中国药房，2013，24（31）∶2884-2886.

［10］胡少南，赵颖，郑一敏，等.见血青的气相色谱-质谱联用分析［J］.重庆理工大学学报（自然科学），2014，28（2）∶54-58.

［11］董艳芳，李伟阳，叶睿超，等.见血青总生物碱的抑菌活性和抗氧化性研究［J］.四川大学学报（自然科学版），2010，47 （3）∶669-673.

［12］宋芹，赵琦，苟小军，等.见血清止血作用研究［J］.成都大学学报（自然科学版），2013，32（1）∶27-28，31.

［13］文旭，葛彦双，崔龙，等.超声波辅助提取见血青总生物碱工艺研究［J］.四川大学学报（自然科学版），2013，32（1）∶182-186.

（责任编辑：叶丽娜）

A Study on Optimization for Extracting Total Alkaloids from Liparis Nervosa

LI Guoping，WANG Yurong，ZHENG Shixue，ZHUANG Huanhuan

（SchooL of EcoLogy and Resource Engineering，Wuyi University，Wuyishan，Fujian 35430）

Abstract:In order to increase the extraction efficiency of totaL aLkaLoids from Liparis nervosa，the infLuences of the ratio of materiaL to soLvent，extraction temperature，extraction time and ethanoL concentration on the yieLd of totaL aLkaLoids by using heating refLux method were studied in this paper. Based on the singLe factor experiments，the optimum extraction technoLogy was determined by orthogonaL design.The optimum extraction conditions were obtained as foLLows∶the ratio of materiaL to soLven 1∶25，extraction temperature 90℃，extraction time 2.5 h and ethanoL concentration 50%. Under the optimized extraction conditions，the content of totaL aLkaLoids in Liparis nervosa herb that coLLected from Wuyishan district was 2.34%.

Key words:aLkaLoid；Liparis nervosa；orthogonaL test；heating refLux method；extraction efficiency

中图分类号：Q946.88

文献标识码：A

文章编号：1674-2109（2016）03-0001-04

收稿日期：2015-08-22

基金项目：福建省林业科学研究项目（闽林科［2013］5号）；福建省科技厅战略性新兴产业重点项目（2014N0030）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310397008、201410397006）。

作者简介：李国平（1966-），男，汉族，教授，主要从事植物多样性保护与可持续利用研究。