补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响※

高　毅　刁志虹　王彦敏　穆春晖　何　源　李　蓓　王双双　杨　琳

(河北省中医院口腔科，河北　石家庄　050011)

实 验 研 究

补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响※

高毅刁志虹△王彦敏1穆春晖2何源李蓓王双双杨琳

(河北省中医院口腔科，河北石家庄050011)

【摘要】目的观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1)碱性磷酸酶(ALP)活性的影响，探讨其对成骨细胞分化的作用机制。方法将20只SD大鼠随机分为含药血清组和无药血清组，各10只。含药血清组大鼠予补肾活血固齿方灌胃，无药血清组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，均灌胃7 d后抽取腹主动脉血制备成含药血清和无药血清。胎牛血清组为直接购买的PAA胎牛血清。分别用含10%含药血清、10%无药血清及10%胎牛血清的培养基培养MC3T3-E1细胞24、48、72 h，检测MC3T3-E1细胞中ALP的含量。结果含药血清组培养24、48、72 h后MC3T3-E1细胞ALP含量均高于胎牛血清组及无药血清组同期水平，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但胎牛血清组与无药血清组同期差异无统计学意义(P>0.05)；含药血清组MC3T3-E1细胞ALP含量随培养时间的延长而明显增加(P<0.05)。结论补肾活血固齿方可增强MC3T3-E1细胞中ALP活性，促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化，且均有一定时间依赖性。

【关键词】成骨细胞；碱性磷酸酶；大鼠；动物，实验；中药疗法

牙周炎是以牙槽骨进行性吸收破坏为主要特征，以牙龈出血、牙周袋形成、牙齿松动等为主要症状的口腔科常见病，根治牙周炎的关键是通过成骨细胞和破骨细胞的调节作用，促进牙槽骨的再生或阻止牙槽骨吸收，成骨细胞在这一过程中发挥重要作用[1]。碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞早期分化的标志酶，它的活性可以代表成骨细胞的分化活性和成骨细胞的分化水平。中医认为，肾为封藏之本，肾藏精，精生髓，而髓又能养骨，肾精足则骨髓生长有源，骨骼可得到营养而强韧，故临床多以补肾类中药治疗牙周炎引起的牙齿松动[2]。本实验拟通过观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨(MC3T3-E1)细胞ALP活性的影响，探讨补肾活血固齿方对成骨细胞分化的作用机制，为临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物及细胞株健康雄性SD大鼠20只，清洁级，体质量280～300 g，饲养环境室温保持在18～25 ℃，空气流通，12 h维持光照，动物在笼中自由摄食饮水，由河北医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(冀)2008-1-033。ATCC CRL-2594小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 Subclone l4)，由中国科学院上海细胞库提供。

1.2中药制备补肾活血固齿方药物组成：淫羊藿15 g，补骨脂15 g，熟地黄10 g，当归10 g，丹参10 g，知母10 g，甘草3 g。药物加10倍量蒸馏水煎煮1.5 h过滤，加同量蒸馏水重煎1.5 h过滤，合并2次滤液浓缩至150 mL装袋备用。中药材由河北省中医院中药房提供，煎制由煎药室完成。

1.3主要实验试剂与仪器

1.3.1实验试剂α-MEM培养基，美国GIBCO公司；胎牛血清，PAA Laboraties GmbH公司；叶酸、胰蛋白酶，美国Amresco公司；β-巯基乙醇，北京鼎国生物技术有限责任公司；乙二胺四乙酸(EDTA)，天津市永大化学试剂开发公司；戊巴比妥，华北制药股份有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，北京索莱宝科技有限公司；ALP试剂盒，上海科华生物工程股份有限公司。

1.3.2实验仪器HF240二氧化碳(CO2)培养箱，上海力申科学仪器有限公司；BSC-1100ⅡA2生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；TE2000-U荧光倒置显微镜，日本NiKon公司；B40型医用低速离心机，安新县白洋离心机厂；D-37520高速离心机、Type354酶标仪，美国Thermo Electron Corporation公司；HKA-A2450-230精密电子天平，意大利BEL Engineering公司；水浴恒温振荡器，江苏金坛市江南仪器厂；全自动生化仪，日本SYSMEX公司。

1.4实验方法

1.4.1血清制备及分组将20只SD大鼠随机分为含药血清组和无药血清组，每组各10只。含药血清组的血清制备：含药血清组大鼠按体表面积折算等效剂量，以0.475 g/kg生药量灌胃，每日2次，连续灌胃7 d，第7 d第2次灌胃后间隔2 h再次灌胃，末次灌胃1 h后，通过腹主动脉取血，以3 000 r/min离心20 min，取上清液，56 ℃水浴灭活30 min，抽滤除菌后，分装，-20 ℃保存备用。无药血清组大鼠以等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，灌胃次数及血清制备方法同含药血清组。胎牛血清组为直接购买的PAA胎牛血清。

1.4.2细胞培养将MC3T3-E1细胞培养于α-MEM培养基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素)，5% CO2、95%湿度、恒温37 ℃的细胞培养箱中培养，每3 d换液1次，7 d左右细胞基本铺满瓶底。吸去原培养液，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗2遍，0.25%胰蛋白酶1 mL，37 ℃消化1 min，镜下观察细胞收缩，变圆，α-MEM培养基1.5 mL终止消化，反复吹打细胞成细胞悬液，移至离心管1 000 r/min离心5 min，吸去上清液，加入适量α-MEM培养基，轻轻吹打，使管底细胞悬浮，分散均匀，用于下一步实验。

1.4.3MC3T3-E1细胞ALP活性检测分别取3块24孔板，每孔接种细胞约15 000个。正常培养48 h后，每块板均换用含10%含药血清、10%无药血清及10%胎牛血清培养基培养，每组设8个复孔，分别于培养24、48、72 h后各取出1块24孔板，吸净每孔培养基，PBS冲洗2遍，每孔加入0.2% Triton X-100 0.5 mL。将24孔板放入4 ℃冰箱，24 h后吹打细胞，直至镜下观察无完整细胞结构。吸出每孔的细胞裂解产物，分别加入离心管中，1 000 r/min离心5 min。每支离心管中的上清液分别移入新的离心管，采用全自动生化仪检测每孔ALP活性。

2结果

3组MC3T3-E1细胞ALP含量比较见表1。

组 别n培养时间24h48h72h胎牛血清组81.277±0.1031.479±0.1701.566±0.227无药血清组81.457±0.1991.604±0.1761.670±0.137含药血清组81.767±0.316*1.819±0.257*△1.918±0.252*#

与胎牛血清组及无药血清组同期比较，*P<0.05；与同组培养24 h比较，△P<0.05；与同组培养48 h比较，#P<0.05

由表1可见，含药血清组培养24、48、72 h后MC3T3-E1细胞ALP含量均高于胎牛血清组及无药血清组同期水平，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但胎牛血清组与无药血清组同期差异无统计学意义(P>0.05)；含药血清组MC3T3-E1细胞ALP含量随培养时间的延长而明显增加(P<0.05)。

3讨论

牙周炎的主要临床症状为牙周袋的形成、袋壁炎症、牙槽骨吸收及牙齿松动,是导致成年人牙齿丧失的主要原因，严重危害患者的健康，影响患者的生活质量。根治牙周炎的关键是能否阻止牙槽骨吸收或促进牙槽骨再生，牙槽骨代谢的稳定依赖于成骨细胞和破骨细胞的平衡，因此治疗牙周炎的药物无论治疗机制如何，最终必须通过调节骨的微环境、成骨细胞与破骨细胞的平衡而发挥作用[3]。

我们所选用的研究对象MC3T3-E1细胞是1981年日本学者Kadama等从新生C57BL/6小鼠颅顶骨细胞中建株的成骨细胞系，具有和原代培养的颅顶成骨细胞ALP活性、基质钙化等类似的生物学特性，常作为研究体外成骨细胞分化及骨代谢的细胞模型[4-5]。成骨细胞在骨形成过程中可分为分裂增殖、分化成熟及基质矿化3个阶段[6]。ALP是骨形成的必需酶，ALP表达升高是启动矿化的必备条件，其作用是为水解磷酸酯为沉积羟基磷灰石提供必要的磷酸，解除其对矿物质形成的抑制作用，从而促进羟基磷灰石的形成，促进细胞成熟、钙化[7-8]。成骨细胞主要在分化早期表达ALP，ALP的表达也标志着成骨细胞分化开始，当成骨细胞处于高度分化时，ALP活性也达到最高，而到成骨细胞分化晚期细胞进入矿化期时，细胞内的ALP活性则开始下降[9-11]。

牙周炎相当子中医学牙宣、齿豁、齿衄范畴，主要病因是脾胃湿热、肾精亏虚、气血不足等。中医很早就注意到肾与牙齿的关系，在《素问·上古天真论》就有“女子七岁肾气盛，齿更发长；丈夫八岁肾气实，发长齿更”的说法。我们经过大量的临床观察及研究，牙周炎患者多数属肾精亏虚型，且应用补肾活血固齿方治疗该型患者疗效显著。补肾活血固齿方是以“肾主骨”理论为基础，方中淫羊藿、补骨脂为君，补肾助阳，强筋壮骨；熟地黄、当归、丹参为臣，补血活血，填精益髓；知母消热泻火，滋阴润燥；甘草清热解毒，调和诸药。

本实验研究结果显示，含药血清组培养的MC3T3-E1细胞内ALP含量明显高于胎牛血清组及无药血清组，且随着作用时间的延长，药物作用效果越明显，显示出一定的时间依赖效应，说明补肾活血固齿方可通过增强ALP活性来促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化，而发挥治疗牙周炎的功效。

参考文献

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[3]黄萍，绍培，赵美林，等.桂皮醛对成骨细胞的增殖及成骨功能的影响[J].中国口腔种植学杂志，2009，14(2):88-89.

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[5]Kodama H, Amagai Y, Sudo H, et al. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria[J]. Jpn J Oral Biol，1981，23：899-901.

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[9]黄洁，程云英.大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究[J].南京铁道医学院学报，2000，19(2):88-90.

Effects of Bushen-huoxue-guchi formula on alkaline phosphatase activities of pre-osteoblasts in mice calvarium

GAOYi*,XIZhihong,WANGYanmin,etal.

*DepartmentofStomatology,HospitalofTraditionalChineseMedicineinHebeiProvince,Hebei,Shijiazhuang050011

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of Bushen-huoxue-guchi formula on alkaline phosphatase (ALP) activities of pre-osteoblasts in mice calvarium (MC3T3-E1), and its treatment mechanism of periodontitis. Methods20 SD rats were randomly divided into medicine-contained serum group (n=10) and non-medicine serum group (n=10). Rats in medicine-contained serum group were received Bushen-huoxue-guchi formula by intragastric administration. Rats in non-medicine serum group were received 0.9% sodium chloride injection by intragastric administration. Blood samples were obtained from abdominal aorta 7 d after intragastric administration, and the serum was separated to medicine-contained serum group and non-medicine serum group. The cells were cultured with 10% medicine-contained serum, 10% non-medicine serum and 10% fetal bovine serum respectively. The contents of ALP in MC3T3-E1 were detected after 24, 48 and 72 h. ResultsThe contents of ALP in medicine-contained serum group after 24, 48 and 72 h were higher than those in fetal calf serum and non-medicine group at the same period, with statistical differences (P<0.05), and there was no statistical difference between fetal calf serum and non-medicine group (P>0.05). The contents of ALP in medicine-contained serum group were obviously increased over time (P<0.05). ConclusionBushen-huoxue-guchi formula can enhance ALP activity of MC3T3-E1 cells, promote differentiation of MC3T3-E1 cells to osteoblasts, with some time-dependence.

【Key words】Osteoblast; Alkaline phosphatase; Rats; Animals; Experiment; Chinese herbs therapy

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.03.027

通讯作者：△河北省石家庄市第一医院口腔科，河北石家庄050011

作者简介：高毅(1965—)，女，教授，主任医师，博士。从事口腔科临床、科研、教学工作。

【中图分类号】R276.8；R285.5

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2016)03-0409-04

※ 项目来源：河北省科学技术厅科学技术研究与发展计划(编号：13277730D)；河北省中医药管理局2014年度中医药类科研计划课题(编号：2014028)

1河北省石家庄市第三医院口腔科，河北石家庄050011

2北京市东城区第一人民医院口腔科，北京100010