益气复脉方对慢性心衰大鼠基质金属蛋白酶活性调节作用的实验研究

张秋月，王保和，刘伟爽，邓雅芳

1.天津中医药大学(天津 300193)； 2.天津中医药大学第二附属医院



益气复脉方对慢性心衰大鼠基质金属蛋白酶活性调节作用的实验研究

张秋月1，王保和2，刘伟爽1，邓雅芳1

1.天津中医药大学(天津 300193)； 2.天津中医药大学第二附属医院

摘要：目的观察注射用益气复脉方(冻干)(YQFM)对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制因子(TIMPs)蛋白表达的影响，探讨益气复脉方对基质金属蛋白酶系统的调节作用与心肌细胞外基质(EMC)重构的相关性。 方法100只雄性wistar大鼠中随机选取90只通过腹主动脉缩窄法制作大鼠慢性心力衰竭模型，10只作为假手术组常规饲养。术后8 w，以多普勒超声心动图检测左室射血分数(LVEF)≤60%为成模标志。成模大鼠随机分为6组：空白模型组、卡托普利组(卡托普利片4.88 mg/kg)、生脉组(生脉注射液4 mL/kg)及益气复脉中、低、高(520 mg/kg，260 mg/kg，1040 mg/kg)剂量组。连续给药14 d后，以HE染色法观察大鼠心肌组织病理变化以蛋白质印记法检测大鼠心肌组织中MMP-2，MMP-3，MMP-9以及TIMP-1，TIMP-2的含量。结果与假手术组比较，空白模型组心肌间质胶原纤维大量增生，EMC结构显著改变，可见局灶性纤维瘢痕；MMP-2、MMP-3、MMP-9含量显著升高(P<0.01)，TIMP-1/2含量显著降低(P<0.01)，MMP-2/TIMP-2比值升高为假手术组的4倍～6倍。与空白模型组比较，各治疗组心肌肌束间及血管周围胶原纤维出现轻、中度增生，MMP-2、MMP-3、MMP-9降低，TIMP-1/2升高，MMP-2/TIMP-2比值降低为假手术组的1～3倍。其中，YQFM各剂量组MMP-2、MMP-3、MMP-9含量显著低于生脉组(P<0.05)，除YQFM低剂量组MMP-2显著高于卡托普利组(P<0.05)外，其余各YQFM组MMP-2、MMP-3、MMP-9含量与卡托普利组比较差异无统计学意义(P>0.05)。YQFM各剂量组TIMP-2含量显著高于生脉组(P<0.05)，与卡托普利组比较差异无统计学意义(P>0.05)；YQFM各剂量组TIMP-1含量与MMP-2/TIMP-2比值显著低于卡托普利组(P<0.05)，与生脉组比较差异无统计学意义(P>0.05)；结论慢性心衰大鼠心肌间质胶原纤维增生、胶原网络结构改变导致EMC重构，与基质金属蛋白酶系统活性增强有关。益气复脉方通过降低MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，升高TIMP-1，TIMP-2的含量，维持 MMP-2/TIMP-2动态平衡，抑制MMPs活性，改善慢性心衰大鼠心肌细胞外基质重构的程度，缓解大鼠慢性心衰症状。

关键词：慢性心衰；基质金属蛋白酶；组织抑制因子；益气复脉方；蛋白质印迹法

心肌细胞外基质(extracellular matrix， EMC)的重构是多种因素引起基质胶原增生、胶原网结构改变的过程，是慢性心力衰竭心室重构发生发展的重要环节。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)及其组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMPs)在EMC降解和胶原网络重构过程中起重要作用。本研究观察益气复脉方(YQFM)对慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)大鼠心肌组织中MMP-2， MMP-3， MMP-9及TIMP-1，TIMP-2蛋白表达的影响，探讨益气复脉方对MMPs系统的调节作用与EMC重构的相关性。

1材料与方法

1.1动物100只清洁级雄性Wistar大鼠，体重220 g～250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[合格证号：SCXK(京)2009-0004]。每笼5只，适应性饲养1周后进行实验。

1.2药品与试剂注射用益气复脉(冻干)，每瓶装0.65 g(相当于红参0.5 g，五味子0.75 g，麦冬1.5 g)，天津天士力之骄药业有限公司生产(批准文号：国药准字Z20060463；产品批号：20130805)。卡托普利片，每片12.5 mg，中美上海施贵宝制药有限公司生产(批准文号：国药准字H31022986；产品批号：1402032)。生脉注射液，每支25 mL，江苏苏中药业集团股份有限公司(批准文号：国药准字Z20053993；产品批号：13070803)；MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2抗体(Abcam公司，美国)由天津易生源生物技术有限公司提供。

1.3实验仪器5418R低温离心机、高速离心机(Eppendorf公司，德国)，BSA124S-CW电子天平(Sartorius公司，德国)，移液枪(Eppendorf公司，法国)，微量加样吸头(北京中衫金桥生物有限公司)，PVDF膜(Millipore公司，美国)，医用X射线胶片(柯达公司，美国)，通用显影粉、酸性定影粉(天津天陆海感光材料厂)，电泳仪、凝胶玻璃板、固定夹、DYCZ-20C垂直电泳槽、DYCP-40C转移槽(北京六一仪器厂)，TS-8转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司)。

1.4造模100只大鼠中随机选取90只，依据文献采用腹主动脉缩窄法制备大鼠慢性心力衰竭模型[1]。术后8周，以多普勒超声心动图检测左室射血分数(LVEF)≤60%，同时大鼠出现体重减轻、精神萎靡、毛色无光泽作为心衰模型成功的标志纳入心衰模型组。余10只为假手术组，腹主动脉只穿线不结扎，常规饲养12周。

1.5分组给药将成模大鼠随机分为6组：①空白模型组不进行药物干预，常规饲养；②卡托普利组：1.56 mg/mL的卡托普利悬浊液，4.88 mg/kg，每日灌胃；③生脉组：生脉注射液4 mL/kg，尾静脉注射；④益气复脉中剂量组(YQFM-M)：注射用益气复脉(冻干)0.65 g溶于4 mL生理盐水，520 mg/kg，尾静脉注射；⑤益气复脉低剂量组(YQFM-L)：0.65 g药物溶于8 mL生理盐水，浓度为中剂量组的0.5倍，260 mg/kg 尾静脉注射；⑥益气复脉高剂量组(YQFM-H)：0.65 g药物溶于2 mL生理盐水，为中剂量组2倍浓度，1 040 mg/kg 尾静脉注射。

1.6HE染色法观察大鼠心肌病理改变连续给药14 d后，处死大鼠，取出心脏，于左心室中部沿横轴切取0.5 cm厚的心肌组织用4%多聚甲醛溶液固定，剩余心尖部迅速置于冻存管内，液氮保存用于蛋白质印迹检测。固定后的心肌组织常规石蜡包埋，制成4 μm～6 μm切片，脱蜡后HE染色，100倍镜下观察大鼠心肌组织病理变化。

1.7蛋白质印迹法检测大鼠心肌组织中MMPs，TIMPs含量以Western blot法对心肌组织内MMP-2，MMP-3，MMP-9以及TIMP-1，TIMP-2进行半定量检测。 收集大鼠心肌的培养细胞充分裂解后，以考马斯亮蓝法测定各细胞样本相应目的蛋白含量，提取总蛋白-80 ℃保存。将样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后将凝胶上分离到的蛋白条带用半干转的方式转印至PVDF膜上。分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。曝光及洗片后用image J软件分析灰度值，并以各目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值， 计算相对灰度值，表示目的蛋白的含量。

2结果

2.1大鼠一般情况术后8 w，模型组大鼠较假手术组大鼠出现：体重减轻、食量减少、精神萎靡、活动度降低；皮毛干枯欠顺滑、毛色暗黄无光泽，备皮部位毛发生长缓慢、稀疏；四肢及尾部皮色淡白，尾静脉充盈较差，血管纤细，颜色黯淡。给药14 d后，各治疗组大鼠活动度明显增强、皮毛光泽度增加；益气复脉中/高剂量组大鼠四肢及尾部色泽红润，尾静脉充盈度较好，明显优于其他治疗组。

2.2心肌组织 HE染色结果病理结果显示：术后10周，假手术组大鼠心脏结构清晰，形态正常，心肌肌束间散在少量胶原纤维，心肌细胞排列规整(见图A)。空白模型组心肌肌束间及血管周围胶原纤维显著增生，可见灶性纤维瘢痕，心肌细胞萎缩或坏死，排列紊乱，间质血管扩张充血，ECM重度重构(见图B)。卡托普利组心肌细胞排列规整，形态正常，偶见心肌肌束间及血管周围胶原纤维增生，ECM重构不明显(见图C)；YQFM中/高剂量组心肌肌束间及血管周围胶原纤维轻度增生，偶见心肌细胞萎缩，心肌细胞排列规整，出现轻度ECM重构见图E/G；生脉组/YQFM低剂量组 心肌肌束间及血管周围胶原纤维轻、中度增生，间质血管轻度扩张充血，偶见灶性区中度增生，局部心肌细胞萎缩，排列稍紊乱， ECM中度重构(见图D/F)。

注：A为假手术组 B为空白模型组 C为卡托普利组 D为生脉组 E/F/G为益气复脉中/低/高剂量组

图1各组大鼠心肌HE染色图片(×100)

2.3心肌组织MMPs，TIMPs含量比较

2.3.1MMP-2，MMP-3，MMP-9相对灰度值比较与假手术组比较，空白模型组MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值差异有统计学意义(P<0.01)。卡托普利组MMP-2，MMP-9灰度值与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)，生脉组MMP-2，MMP-9灰度值与空白模型组比较无统计学意义(P>0.05)，其余各治疗组MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值均显著低于空白模型组(P<0.01，P<0.05)，显著高于假手术组(P<0.05，P<0.01)。其中，YQFM各剂量组MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值显著低于与生脉组(P<0.05)；除YQFM低剂量组MMP-2灰度值显著高于卡托普利组(P<0.05)外，其余各YQFM组MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值与卡托普利组比较无统计学意义(P>0.05)。见表1，详见图2。

表1　大鼠心肌组织MMP-2，MMP-3，MMP-9相对灰度值比较(±s)

2.3.2TIMP-1/2相对灰度值比较空白模型组大鼠TIMP-1/2灰度值显著低于假手术组(P<0.01)，给药各组TIMP-1/2灰度值较空白模型组显著上升(P<0.01或P<0.05)。其中，卡托普利组TIMP-1灰度值明显高于生脉组及益气复脉各剂量组(P<0.05)，与假手术组比较无统计学意义(P>0.05)。YQFM各剂量组TIMP-2灰度值显著高于生脉组(P<0.05)，与卡托普利组比较无统计学意义(P>0.05)。详见表2、图2。

表2　大鼠心肌组织TIMP-1，TIMP-2，MMP-2/TIMP-2相对灰度值比较(±s)

2.3.3MMP-2/TIMP-2含量比值空白模型组大鼠MMP-2/TIMP-2比值显著升高，达到假手术组的4倍～6倍(P<0.01)。与空白模型组比较，给药各组MMP-2/TIMP-2比值显著下降(P<0.01)，为假手术组的1倍～3倍；YQFM各剂量组与生脉组差异不明显(P>0.05)，卡托普利组MMP-2/TIMP-2比值<1，显著低于其他给药组(P<0.05)。详见表2。

注：A为假手术组 B为空白模型组 C为卡托普利组D为生脉组 E/F/G为益气复脉中/低/高剂量组。

图2各组大鼠MMPs，TIMPs蛋白含量条带图

3讨论

在CHF进展过程中，EMC合成与降解失衡，使心肌细胞间质蛋白结构与成分发生改变，从而导致心肌组织形态、结构功能的异常。存在于心肌中的MMPs活性的增强是心室重构的始动因素[2]。其中，明胶酶(MMP-2和MMP-9)、基质分解素(MMP-3) 可分解多数ECM成分；MMP-3的活性早期升高有利于其它MMPs的激活[3]。因此，MMP-2、MMP-3、MMP-9是心肌细胞外基质重构时主要的酶。TIMPs是MMPs特异性内源抑制因子，TIMPs与MMPs以1∶1(摩尔比)的比例结合形成的MMP-TIMP复合体的形式，抑制MMPs的活性。TIMP -1主要抑制MMP -1、MMP -3和MMP -9；TIMP -2主要抑制MMP -2，并只随MMP -2表达而表达。通过竞争性结合，TIMPs可以阻断活化的MMPs与胶原结合，进而减少基质降解[4]。MMPs/TIMPs的动态平衡是维持心肌胶原纤维及心脏结构正常的重要因素。研究表明，随着MMPs活性升高，TIMPs是降低的[5]。在心肌病晚期，心肌内MMPs活性升高，与TIMPs对MMPs的抑制作用丧失有关；减少MMPs-TIMPs复合物水平可使MMPs活性升高[6]。

本研究结果显示，CHF大鼠心肌细胞外基质发生病理学改变：正常形态的胶原网络降解，异常结构的胶原大量增生沉积，形成灶性纤维瘢痕，引发EMC重构。这与CHF大鼠心肌MMP-2，MMP-3，MMP-9含量增加、活性增强，TIMP-1，TIMP-2含量下降、对MMPs抑制作用减弱，MMP-2/TIMP-2比值显著升高有关。经药物治疗后，各组MMPs含量下降，TIMPs含量升高。益气复脉(冻干)对MMP-2，MMP-3，MMP-9的降低作用与对TIMP-2的升高作用与卡托普利等效，均优于生脉注射液；益气复脉(冻干)对TIMP-1的升高作用与对MMP-2 /TIMP-2比值的降低作用不及卡托普利，与生脉注射液无差异。

中医学将慢性心衰归为“心悸”“怔仲”“水肿”“咳喘”“痰饮”“心痹”等病症的范畴。心气不足、气阴两虚乃至心阳虚衰、本虚标实为其主要的证候演变规律。益气复脉方来源于张元素所著《医学启源》中的名方生脉散，谓之“人有将死脉绝者，服此能复生之，其功甚大”。生脉注射液是生脉散经现代方法提取红参、麦冬、五味子的有效成分制成，具有益气养阴、复脉固脱之效。该制剂可提高心肌收缩力、增强心脏泵血，且毒性小、安全度大[7]，为改善心功能、缓解心衰症状的常用药物。注射用益气复脉(冻干)是目前唯一的冻干粉剂型的益气复脉剂，采用冷冻干燥技术提取，95%以上的明确成分可通过指纹图谱得到体现，较传统水针剂更加稳定、质量更可控[8]。

本研究中模型组大鼠在术后8周出现明显的慢性心衰体征：体重减轻、精神萎靡、活动度下降、四肢及尾部微循环障碍。给药后大鼠心衰症状明显缓解，活动度增强；而中/高剂量的益气复脉(冻干)对心衰大鼠皮肤、四肢、尾静脉循环状态的改善作用明显优于卡托普利、生脉注射液及低剂量益气复脉(冻干)。有关模型动物中医证型规范化标准化的研究证明：睡眠剥夺后引起大鼠左室功能的降低，与气阴两虚时，血运无力相吻合[9]。

慢性心衰大鼠心功能降低，出现气阴两虚证候时，益气复脉方对大鼠循环障碍症状的缓解作用，既是其益气养阴、益心复脉功效的体现。这可能与益气复脉方能降低MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，升高TIMP-1，TIMP-2的含量，维持 MMP-2/TIMP-2动态平衡，抑制了基质金属蛋白酶的活性，改善慢性心衰大鼠心室重构的作用有关。

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[8]孙兰军，郑偕扣，郝长颖.注射用益气复脉(冻干)治疗冠心病心力衰竭的多中心临床研究[J].中国当代医药，2012，19(17)：7-10.

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(本文编辑 薛妮)

Regulative Effects of Yiqifumai Injection on the Activity of Matrix Metalloproteinase in Rats with Chronic Heart Failure

Zhang Qiuyue，Wang Baohe，Liu Weishuang，Deng Yafang

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China

Abstract：Objective To investigate the regulative effect of Yiqi Fumai injection(YFI) on the activity of matrix metalloproteinase (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMPs) in rats with chronic heart failure(CHF)，and explore the regulation of YFI on MMPs and its correlation with the reconstruction of myocardial extracellular matrix(EMC).MethodsOne hundred Wistar rats were randomly divided into sham group (n=10) and model group(n=90).The CHF rat model was established by abdominal aortic banding.After 8 weeks of operation， rats were divided into 6 groups：blank model group， captopril group，Shengmai injection(SMI) group， YFI groups(high-，medium-，low-dosage).After 14 days， the myocardial pathological changes were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1 and TIMP-2 in myocardial tissue were detected by western blotting.ResultsCompared with sham group， myocardial interstitial collagen fibers proliferated， EMC structure changed，focal fibrous scars were visible in blank model group.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 and MMP-2/TIMP-2 ratio increased while the contents of TIMP-1 and TIMP-2 decreased in blank model group.Compared with blank model group group，the light and moderate proliferation of collagen fibers appeared around myocardial muscle bundle and vessels in captopril group， SMI group， YFI groups.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 and MMP-2/TIMP-2 ratio decreased while the contents of TIMP-1 and TIMP-2 increased in captopril group， SMI group， YFI groups.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 in YFI groups were lower than that in SMI group(P<0.05).The content of MMP-2 in YFI low-dosage group was higher than that in captopril group(P<0.05).The contents of TIMP-2 in YFI groups were higher than that in SMI group(P<0.05).The content of TIMP-1 and MMP-2/TIMP-2 ratio in YFI groups were lower than that in captopril group(P<0.05).ConclusionThe myocardial interstitial collagen proliferation and collagen structure changes induce the reconstruction of EMC in rats with CHF， which is relevant to the enhancement of MMPs activity.YFI can inhibit MMPs activity and improve myocardial EMC remodeling by by lowering the content of MMP-2，MMP-3，MMP-9， increasing the content of TIMP-1，TIMP-2， maintaining MMP-2/TIMP-2 homeostasis in rats with CHF.

Key words：chronic heart failure； matrix metalloproteinase；tissue inhibitor of metalloproteinase；Yiqi Fumai injection；western blotting

基金项目：国家自然基金项目(No.81173241)

通讯作者：王保和，E-mail： wbh3423@sina.com

中图分类号：R541.6R289.5

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．009

文章编号：1672-1349(2016)08-0825-05

Corresponding Author：Wang Baohe (The Affiliated Second Hosipital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin，China)

(收稿日期：2015-08-11)

·基础医学论著/研究·