CTLA-4基因多态性与肝细胞癌易感性的相关分析*

王甲甲，张　娟，王智斌，黄文芳

(四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都 610072)



CTLA-4基因多态性与肝细胞癌易感性的相关分析*

王甲甲，张娟△，王智斌，黄文芳

(四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都 610072)

[摘要]目的分析细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因多态性-318 T/C、CT60 G/A与肝细胞癌(HCC)易感性之间的相关性。方法选取于2012年9月至2014年8月就诊于四川省人民医院的277例HCC患者及306例健康体检者作为研究对象，所有研究对象均为汉族人。抽取各研究对象外周血5 mL，离心分离血清，采用化学发光法检测血清中甲胎蛋白(AFP)的水平；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中白细胞介素(IL)-2、IL-4、转化生长因子-β(TGF-β)的水平。抽提全血基因组DNA，PCR扩增后直接测序法检测CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A基因多态性的分布。结果CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A的3种基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。CTLA-4 -318 CC和CT60 AA与降低HCC的风险有关，CTLA-4 CT60 G/A不同基因型与血清AFP水平有明显相关性(χ2=12.779，P=0.012)。携带CTLA-4 -318 T、CT60 G等位基因的HCC患者血清中IL-2、IL-4水平明显降低，TGF-β水平显著升高，且CTLA-4 -318 T与HCC的分级有明显的相关性。结论CTLA-4 -318 TT能够促进HCC的发生、发展，这可能与下调Th1/Th2型细胞因子，上调Th3型细胞因子有关。

[关键词]细胞毒T淋巴细胞抗原4；基因多态性；肝细胞癌；细胞因子

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌的年死亡率达20/10万，在恶性肿瘤的死亡率中高居第2位，对社会带来了巨大的负担[1]。乙型肝炎病毒(B type hepatitis virus,HBV)是公认的肝癌发病的高危因素，大多数肝癌为肝细胞型，然而并非所有感染HBV的患者均会发展成肝癌，环境因素和免疫学因素可能在肝癌的发生、发展中起关键作用[2]。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)基因位于染色体2q33上，能够通过与CD28竞争结合B7-1/B7-2，发挥其负向调节T细胞增殖、激活的作用，下调T细胞反应和外周耐受[3]。CTLA-4基因有多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位点及重复序列，SNP的存在可从不同的方面影响CTLA-4基因的表达，目前，已有实验证据表明CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A与宫颈癌、肺癌、淋巴瘤等的遗传易感性有关[4-6]，而CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A是否与肝癌的发病有关仍未见报道。本研究对CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的易感性进行研究，以期为肝癌的治疗及风险预测提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料选取2012年9月1日至2014年8月31日本院确诊的HCC患者共277例(HCC组)，年龄24～73岁，平均(53±12)岁，男235例，女42例，且经病理学、影像学及肝脏穿刺活检证实，所有患者血清均在未做任何治疗前采集。对照组选择本院体检中心无血缘关系的健康体检者306例，年龄22～70岁，平均(51±13)岁，男 266例，女40例。HCC组和对照组均为四川汉族人群，组间年龄及性别构成比相匹配，并排除糖尿病、甲状腺功能亢进、类风湿关节炎等自身免疫疾病史，无传染病史、免疫疾病治疗史或其他恶性肿瘤病史。HCC的诊断参照《中华肝脏病杂志》新的HCC诊断标准并经病理学确诊[7]。本研究获得医院医学伦理委员会批准，临床资料及标本采集均获患者知情同意。

1.2方法

1.2.1标本的收集采集空腹外周静脉血5 mL分别置于红色无抗凝剂干燥管和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)紫色抗凝管(美国BD公司)。干燥管室温静置15 min，待其自然凝固后，以1 500 g离心5 min，收集血清用于甲胎蛋白(AFP)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、转化生长因子-β(TGF-β)水平的检测。抗凝血采用全血基因组小量抽提试剂盒(北京三博远志生物公司)提取全血DNA作为聚合酸链反应(PCR)模板，操作步骤按试剂盒说明书进行。分离的血清及抽提的基因组DNA均置于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2血清AFP水平的检测血清AFP水平的检测均采用化学发光法。所有标本依次用全自动化学发光仪i2000SR(美国雅培公司)进行测定。

1.2.3细胞因子的测定血清中细胞因子IL-2、IL-4、TGF-β水平的检测采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。应用人IL-2、IL-4、TGF-β ELISA试剂盒(美国R&D公司)进行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.4PCR扩增及测序分析用紫外分光光度计检测DNA的浓度，并用去离子水调整其浓度至 5 ng/μL。PCR引物用Primer premier 5.0软件设计，由上海生物工程公司合成。CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A的引物分别如下，-318 T/C (F:AGGATGGTGCTTCACAGAT;R:AGCCAATCCATGGAT GGA)，产物长度为341 bp；CT60 G/A (F:TGCAAGTCATTCTTGGAAG;R:CTGTGATAGTT GAGCTGA),产物长度为395 bp。PCR反应体系20 μL：基因组DNA 2 μL(约0.2 μg)，10×PCR Buffer 2 μL，25 mM MgCl2溶液2 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，1 U/μL Taq DNA聚合酶(Fermentas中国公司)2 μL和5 μmol/L上、下游引物各1 μL，灭菌ddH2O 8 μL。反应参数：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃ 再延伸5 min。反应结束后取PCR产物3 μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳，确定PCR产物为目的片段，且无非特异性扩增后，直接送上海生物工程公司测序。

2结果

2.1两组临床及生化指标的比较对HCC组和对照组的基本情况进行统计，结果表明，两组间年龄、性别之间基本无差异(P>0.05)。86.6%的HCC患者均能检测到HBV感染呈阳性。根据癌细胞的分化程度，将肝细胞癌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4级，以中分化型HCC(Ⅱ、Ⅲ)最为多见，见表1。

表1　两组对象临床及生化指标比较[n(%)]

-：此项无数据。

2.2不同组别基因型和等位基因频率分析CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A的3种基因型均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。CTLA-4 -318 CC和CT60 AA与降低HCC的风险有关(P=0.000，OR：0.579，95%CI：0.449～0.747；P=0.000，OR=0.453，95%CI：0.351～0.586)。与对照组相比，携带CTLA-4 -318 T，CT60 G等位基因的HCC患者明显增加(P<0.05),见表2。

表2　不同组别CTLA-4 SNPs的分布情况[n(%)]

-：此项无数据。

2.3CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型与AFP浓度的相关性对携带CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型的HCC患者血清AFP浓度进行检测，结果见表3。按AFP水平的高低共分为<20 ng/mL(低)、20～200 ng/mL(中)、>200 ng/mL(高)3个等级，对携带不同基因型的HCC患者的AFP水平进行分类，结果表明，CTLA-4 -318 T/C不同基因型与血清AFP水平无明显相关性(P>0.05)，而CT60 G/A不同基因型与血清AFP水平有明显相关性(χ2=12.779，P=0.012)。

2.4CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型与细胞因子的关系见表4，对照组携带CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同等位基因与血清IL-2、IL-4、TGF-β水平均无明显相关关系(P>0.05)。在HCC组，与携带-318 C、CT60A等位基因的患者相比，携带-318 T、CT60 G等位基因的患者血清中IL-2、IL-4、TGF-β水平均有明显变化，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3　CTLA-4 不同基因型与AFP浓度的相关性[n(%)]

表4　CTLA-4 基因多态性与血清细胞因子水平的关系±s)

CTLA-4 -318 TT与TC+CC，CT60 GG与AG+AA相比较。

2.5CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A与临床病理学分级之间的相关性随着HCC恶性程度的增加，CTLA-4 -318的基因型发生了从CC到TT的转变，CT60的基因型发生了从AA到GG的转变。通过比较发现，CTLA-4 -318基因型在不同分级HCC患者中的分布差异有统计学意义(χ2=34.448，P<0.05)，而CTLA-4 CT60基因型在各分级HCC患者中分布差异无统计学意义(χ2=11.137，P>0.05)，见表5。

表5　CTLA-4 -318、CT60不同基因型在HCC患者中的分布

3讨论

CTLA-4是一种很重要的免疫抑制分子，CTLA-4与T细胞表达的CD28共同竞争结合于抗原提呈细胞B7分子，发挥免疫抑制作用[8]。CTLA-4基因有多个SNP存在，单碱基的变化可影响氨基酸的改变，进而造成蛋白表达的异常，影响其和配体的结合，其中，位于CTLA-4基因启动子区的-318及非翻译区的CT60 SNP位点的变异被证实与哮喘、系统性红斑狼疮、Graves病等自身免疫性疾病的发生有关[9-11]，也有研究对CTLA-4 -318、CT60 SNPs与宫颈癌、肺癌等多种肿瘤的关系作了探讨[4-5]，但仍未有关于CTLA-4 -318、CT60 SNPs与肝癌相关性的报道。

本研究旨在探讨CTLA-4 -318、CT60 SNPs与HCC的相关性，由于HBV感染是导致肝细胞癌的高危因素，所有参与对象均需进行常规的HBV检测，结果发现，86.6%的HCC患者HBV检测呈阳性，这与其他研究报道结果基本一致[12]。对各参与者CTLA-4 -318 T/C,CT60 G/A基因多态性进行检测，结果显示，CTLA-4 -318 CC和CT60 AA与降低HCC的风险有关，-318 T和CT60 G等位基因均与HCC的发生有明显关系。

长期以来，AFP 被认为是诊断肝癌最好的肿瘤标志物，特异性较高，但其敏感度仅为40%～65%，仍有近1/3的肝癌患者血清AFP呈阴性或低浓度，有相当高的漏诊率[13]。在本研究中，对所有HCC患者的AFP水平进行检测，结果发现，AFP<20 ng/mL的患者占15.2%，20～200 ng/mL的患者占18.4%，而AFP>200 ng/mL的患者占66.4%，其中，AFP阴性或低浓度的HCC患者占33.6%，与国内其他研究报道相一致[13]。对携带CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型的HCC患者血清AFP浓度进行检测，结果发现，CTLA-4 -318 T/C不同基因型与血清AFP水平无明显相关性，而CT60 G/A不同基因型与血清AFP水平有明显相关性(χ2=12.779，P=0.012)。目前，仍没有HCC患者CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型与血清AFP水平相关性方面的研究，因此，该结论仍需进一步通过扩大标本量进行验证。

CTLA-4目前被认为是调节性T细胞的标志物，能够分泌TGF-β，IL-10两种细胞因子(Th3型细胞因子)，抑制CD4+Th细胞和CD8+细胞毒性T细胞的作用，下调抗肿瘤免疫反应[14]。因此，笔者推测，CTLA-4 SNPs可能通过激活细胞因子通路调节HCC发生的敏感性。在本研究中，分别对不同CTLA-4基因型与血清Th1型细胞因子IL-2、Th2型细胞因子IL-4、Th3型细胞因子TGF-β 水平之间的相关性进行检测，结果显示，携带CTLA-4-318 TT和CT60 GG的HCC患者血清中IL-2、IL-4水平均较低，而TGF-β水平较高。这些研究结果初步证实，CTLA-4-318 T和CT60 G等位基因在HCC的发生中发挥重要作用，其可能是通过下调Th1/Th2型细胞因子的表达，上调Th3型细胞因子的表达来实现的。

对CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A与临床病理学分级的相关性进行分析，结果发现，随HCC恶性程度的增加，CTLA-4 -318、CT60的主要基因型分别发生了从CC到TT，AA到GG的转变。不同CTLA-4 -318基因型的HCC分级有明显统计学差异，而CTLA-4 CT60基因型在各分级HCC患者中分布无统计学差异。该实验进一步证实了CTLA-4 -318T在HCC发生、发展中的作用。

综上所述，CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A均与HCC的发生有密切关系，其可能与下调Th1/Th2型细胞因子，上调Th3型细胞因子有关，且-318 T/C与HCC的进展有明显相关关系，而CT60 G/A与HCC的进展无关。从遗传学的角度认为携带-318T、CT60G等位基因存在肝癌遗传易感性，但肿瘤的发病是多基因遗传与多环境因素共同作用的结果，故该结果可能仍存在一定的局限性。因此，今后应在扩大样本量的基础上对CTLA-4基因多态性与肝癌之间的关系进行深入研究，以进一步明确其在肝癌发生、发展过程中的作用。

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Analysis on correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen 4 gene polymorphisms and susceptibility to hepatocellular carcinoma*

Wang Jiajia,Zhang Juan△,Wang Zhibin,Huang Wenfang

(Department of Clinical Laboratory,Sichuan Provincial Academy of Medical Sciences/Sichuan Provincial People′s Hospital,Chengdu Sichuan 610072,China)

[Abstract]ObjectiveTo analyse the correlation between cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) gene polymorphism -318 T/C,CT60 G/A and the susceptibility of hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsTotally 277 cases of HCC and 306 healthy controls in our hospital from September 2012 to September 2014 were selected as the research subjects,all subjects were Han nationality.The peripheral blood (5 mL) in each case was collected for separating serum,the AFP level was detected by chemilunescent method,the serum IL-2,IL-4 and TGF-β levels were detected by ELISA.Genomic DNA was extracted,after PCR amplification,the CTLA-4 -318 T/C,CT60 G/A gene polymorphism distributions were detected by the direct sequencing method.ResultsThe CTLA-4 -318 CC and CT60 AA genotypes all conformed to the Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05).CTLA-4 -318 CC and CT60 AA were related with the HCC risk decrease,different genotypes of CTLA-4 CT60 G/A had obvious relation with serum AFP level(χ2=12.779，P=0.012).The serum IL-2 and IL-4 levels in the HCC patients carrying CTLA-4 -318 T and CT60 G allele were significantly decreased,while the TGF-β level was significantly increased,moreover CTLA-4 -318 had obvious relation with the HCC grading.ConclusionCTLA-4 -318 TT could promote the occurrence and progression of HCC,which might be related with the down-regulation of Th1/Th2 type cytokines,and up-regulation of Th3 type cytokine.

[Key words]cytotoxic T lymphocyte antigen 4;genetic polymorphisms;hepatocellular carcinoma;cytokines

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.011

* 基金项目：四川省卫生和计划生育委员会基金资助项目(140071)。

作者简介：王甲甲(1984-)，博士，主管技师，主要从事肿瘤免疫学方面的研究。△通讯作者，E-mail：xywjj08@163.com。

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)09-1186-04

(收稿日期：2015-09-15修回日期：2015-12-13)