人参皂苷Rg1对非酒精性脂肪肝病大鼠脂肪酸β-氧化的改善作用研究

2016-06-15 01:45廖文云

重庆医学 2016年9期

廖文云,徐　丹

廖文云1,徐丹2△

[摘要]目的研究人参皂苷Rg1对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠β-氧化的作用。方法将120只SD大鼠分为对照组(CON组)、模型组(HFD组)及人参皂苷Rg1低、中、高剂量组(GLD、GMD、GHD组)和熊去氧胆酸钠治疗组(PDT组)，每组20只，分别于治疗4、8周后处死大鼠各半，肝脏切片HE染色，检测肝功能、血脂、肝脏脂酰CoA合成酶1(CoASH1)、脂酰肉毒碱转移酶I(CATI)及酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1) mRNA和蛋白表达。结果治疗4周后，肝脏HE染色GHD组有改善，PDT、GLD、GHD组未见改善；8周后，PDT组与GLD组仍有少量脂肪颗粒聚集，GMD组和GHD组看不到任何脂滴浸润；治疗4周后，PDT、GLD、GMD、GHD组与HFD组相比，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显降低(P<0.05)，8周后进一步降低；治疗4周后，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)4个组均升高，8周后几乎恢复到对照组的水平；治疗4周后肝脏组织CoASH1、CACTI及ACOX1表达4个组均显著升高(P<0.05)，治疗8周后改善更为明显。结论人参皂苷Rg1可通过调节大鼠β-氧化来改善脂代谢及肝功能。

[关键词]人参皂苷Rg1；非酒精性脂肪肝病；脂酰CoA合成酶；脂酰肉毒碱转移酶I；酰基辅酶A氧化酶1

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是临床中较为常见的一种代谢性肝病，随着人们饮食习惯的改变，该病有增加的趋势。最新的研究显示我国NAFLD发病率已高达25%，已经成为仅次于病毒性肝炎的第2大疾病[1-2]。人参皂苷Rg1是从人参以及三七中提取的一种皂苷单体化合物，近年来关于其在药学领域中的价值受到了众多学者的关注[3]，Tushuizen等[4]研究显示人参皂苷Rg1有促进大鼠海马神经发育的作用，Zhou等[5]研究显示人参皂苷Rg1对肿瘤有很好的抑制作用，同时其对糖尿病糖代谢也有一定的促进作用。目前关于人参皂苷Rg1对NAFLD的作用也有文献报道[6]，但具体机制尚不清楚，本文拟观察人参皂苷Rg1对NAFLD大鼠β-氧化的作用，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠120只，体质量160～180 g，大鼠[合格证号：SYXK(滇)2011-0004]、基础饲料均由昆明医科大学动物实验部提供。

1.2试剂猪油市场自购；胆固醇及胆酸钠购自上海金穗生物公司；人参皂苷Rg1由昆明医科大学药学院提供；三酰甘油(triglycerides，TG)、胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(ligh-density lipoprotein-C，LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein-C，HDL-C)试剂盒由南京建成生物提供；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及碱性磷酸酶(AKP)等试剂盒购自上海达为科生物科技有限公司；引物为上海英骏生物有限公司生产；总RNA提取试剂盒购自天根生物有限公司；琼脂糖购自美国Invitrogen生物公司；抗体肉碱酰基转移酶Ⅰ(carnitine acyltransferase I，CATI)，脂酰CoA合成酶1(Acyl-CoA synthetase1，CoASH1)及乙酰辅酶A氧化酶1(Acyl-CoA oxidase1，ACOX1)购自美国Santa Cruz公司，二抗购于中杉金桥公司。

1.3方法

1.3.1大鼠饲料构成和造模方法大鼠高脂饲料的配方完全参考国际上目前流行的配方[7]，所配制饲料由昆明医科大学动物试验部加工完成，具体成分为：猪油20%、TC 2%、胆酸钠0.5%及常规饲料营养成分构成。在造模期间所有造模组大鼠均给予充足的饲料和高浓度红糖水饮用，造模时间为8周，8周后每组各取二组大鼠检测其肝功能以及行肝脏HE染色检验是否造模成功。

1.3.2NAFLD模型的建立及给药方法为防止造模过程中大鼠死亡，本次共饲养150只大鼠，期间20只大鼠给予普通饲料作为空白对照组(CON组)，剩余130只大鼠给予造模，期间有16只死亡，将造模成功的114只大鼠根据给药剂量的不同随机分组，共分为5组，其中高脂饮食组(不给予后期治疗，HFD组，n=20)、人参皂苷Rg1低、中、高剂量干预组(GLD、GMD、GHD组，n=24)及熊去氧胆酸钠治疗组(PDT组，n=22)，造模成功后CON组及HFD组均不予任何干涉，GLD、GMD、GHD组分别给予人参皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg-1·d-1治疗。

1.3.3标本采集在大鼠处死前严格控制卫生，所有手术人员均消毒且佩戴手套及口罩；之后开始采集标本，采集时首先称取大鼠体质量、然后给予水合氯醛麻醉；麻醉后将大鼠固定于解剖板上暴露腹腔，手术刀沿腹中线迅速切开腹部取出肝脏，之后使用注射器从心脏取血，将血液离心后和肝脏置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.4病理学检查及相关指标检测方法病理学检查采用HE染色，取样时统一取肝左叶置于4%的中性甲醛中浸泡，之后交由云南省第一人民医院病理科完成。TC、TG、HDL-C以及LDL-C等指标的测定严格按照试剂盒说明书完成。

1.3.5RT-PCR检测mRNA的表达用微量天平精确称取30 mg肝脏组织，立即用相应试剂盒提取总RNA并定量，将定量后的RNA采用超纯水调平，之后根据逆转录试剂盒提示每组取2 μg逆转录cDNA，逆转录完成后将cDNA进行产物扩增，扩增条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后给予72 ℃总延伸5 min。扩增完成后进行琼脂电泳，拍照收集条带图像，Image J计算荧光强度值，每组实验重复3次。CoASH1引物设计为，Primer A：5′-CTT CGG TCG TGA TGA AAG GA-3′，Primer B：5′-ATA GCT GAC GGT TGC CGT AC-3′，产物长度为158 bp。CATI引物设计为，Primer A：5′-CTT GCA TGG CTG TGA GAA GA-3′，Primer B ：5′-AGT CGG ACT GCC TTC AGT GA-3′，产物长度为188 bp。ACOX1引物设计为，Primer A：5′-GTT ACG TGG CGC ATT GAA GA-3′，Primer B ：5′-TAG TTC CTC GCG GGA ACG AT-3′，产物长度为169 bp。β-actin引物设计为，Primer A：5′-GTG ACG AGG CCC AGA GCA AGA G-3′，Primer B：5′-ACG CAG CTC ATT GTA GAA GGT GTG G-3′，产物长度为123 bp。

1.3.6Western blot检测蛋白表达用微量天平精确称取肝脏100 mg，立即用组织裂解液制作匀浆，匀浆制作好后4 000 r/min离心收集上清液，上清液提取后采用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，定量后将蛋白调平，之后每组各取60 μg 进行SDS聚丙烯酰胺凝电泳，电泳完成后半干转移到PVDF模，然后按照常规方法添加一抗二抗反应，ECL发光试剂曝光洗片，图像扫描后用Image J计算各条带荧光值，每组实验重复3次。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠肝脏HE染色比较肝脏切片HE染色可以看出，CON组细胞表面光滑、大小均一，没有任何脂肪空泡，而HFD组细胞有一定的肿胀，且细胞核受到了一定的挤压，提示有脂肪空泡的存在，治疗4周后，脂肪空泡数量均明显减少，治疗8周后脂肪空泡进一步减少，但仍有一定的炎性反应，见图1。

2.2各组大鼠肝功能比较治疗4周后，PDT、GLD、GMD、GHD组与HFD组比较，AST、ALT及AKP水平明显降低(P<0.05)，同时可看出PDT组改善没有GLD、GMD、GHD组明显；治疗8周后，PDT、GLD、GMD、GHD组与HFD组比较，ALT、AST和AKP 进一步降低，和CON组基本一致，同时可发现PDT改善效果与GLD及GMD相近，但仍然没有GHD组降低得多，见表1。

2.3各组大鼠血脂水平比较治疗4周后，4个治疗组TC均明显低于HFD组(P<0.05)，同时PDT组低于GLD组，与GMD组及GHD组基本相近；TG水平PDT、GMD、GHD组要明显低于HFD组(P<0.05)，PDT 组与GMD组改善大体一致，好于GLD组，但没有GHD组改善明显；HDL-C水平GMD组及GHD组要明显高于HFD组(P<0.05)，PDT组低于GLD、GMD、 GHD组；PDT组与GLD、GMD、GHD组LDL-C水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但均低于HFD组(P<0.05)。治疗8周后，TC、TG及HDL-C 3个指标PDT组没有 GLD、GMD、GHD组改善明显；LDL-C与4周时情况基本一致，见表2。