基于改进标准加入法的碳酸饮料中防腐剂和甜味剂高通量筛查分析

王素方，刘 云，弓丽华，董春红，符德学，王国庆*

1. 郑州轻工业学院材料与化学工程学院，河南 郑州 450001 2. 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河南 郑州 450003 3. 焦作大学怀药工程研究中心，河南 焦作 454003

基于改进标准加入法的碳酸饮料中防腐剂和甜味剂高通量筛查分析

王素方1，2，刘 云1，弓丽华1，董春红3，符德学3，王国庆1*

1. 郑州轻工业学院材料与化学工程学院，河南 郑州 450001 2. 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河南 郑州 450003 3. 焦作大学怀药工程研究中心，河南 焦作 454003

利用正交设计分别配制含有三种防腐剂、四种甜味剂的模拟水样，采用核独立成分分析(KICA)处理模拟水样与加入不同含量标准品的饮料样品的紫外光谱(UV)数据，得到其中待测添加剂或背景成分的UV轮廓的独立组分(IC)信息，以IC的系数矩阵进行支持向量回归(SVR)分析，建立模拟样品中防腐剂与甜味剂的UV-KICA-SVR预测模型。添加不同含量水平添加剂的碳酸饮料样品，采用KICA处理其测试得到的UV光谱数据，得到与添加剂对应的IC信息及量，加入量与预测量线性回归方程截距即为饮料中添加剂含量。利用化学计量学“盲源信号分离”方法提取饮料样品中的待测添加剂IC信息与样品基质信息，利用SVR对解析得到的IC信号回归分析建模，改进传统单一组分测定的标准加入法，建立了碳酸饮料样品中防腐剂和甜味剂高通量筛查分析的新方法。方法用于测定碳酸饮料中山梨酸钾，苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯钠三种防腐剂与糖精钠、安赛蜜，阿斯巴甜和甘草酸铵四种甜味剂含量，检测限(LOD)为0.2～1.0 mg·L-1，测定结果与传统的色谱方法相当。

独立成分分析； 支持向量回归； 标准加入法； 防腐剂； 甜味剂； 碳酸饮料

引 言

为了防止食品变质腐烂，增强食品的味觉，在食品加工过程中添加防腐剂和甜味剂。根据中华人民共和国食品安全国家标准[1]，食品中允许使用的防腐剂主要有对羟基苯甲酸甲酯钠、山梨酸钾、苯甲酸钠等，甜味剂主要有糖精钠、安赛蜜，阿斯巴甜和甘草酸铵，同时为了避免这些添加剂过量摄入对人体的潜在伤害，规定了不同类型食品中添加剂允许的最大使用限量。

传统的饮料中食品添加剂的测定多用色谱法，需要比较繁琐的样品预处理，仪器设备及试剂消耗等费用较高[2]。光谱分析具有快速简便、样品处理简单、费用低廉的特点，但在测定多种添加剂共存、被测对象谱峰重叠严重时无法直接利用多元线性分析，往往需要借助偏最小二乘法、支持向量回归(SVR)等方法[3-6]，但是当食品基质中有其他成分的背景干扰时会对测定造成一定的影响。为了有效消除背景对测定结果的影响，研究人员对标准加入法进行了改进，这些改进的标准加入法多用于复杂基质中1-2种成分的测定[7-9]。王国庆等[10]曾将SVR与UV光谱技术结合的改进对标准加入法，建立了碳酸饮料中6色素筛查分析方法，但是此种UV-SVR法不能提供样品中被测对象以外其他成分构成的背景信号信息。本研究拟在UV-SVR建模时引入具有“盲源信号”分离潜能的新型化学计量学方法[11-17]，分别对防腐剂、甜味剂两类模拟水样、饮料中加入不同含量添加剂的加标样品，测定其UV光谱数据，经核独立成分分析(KICA)提取得到的独立组分(IC)，以此作为添加剂及背景成分UV光谱轮廓定性信息，进一步以添加剂IC的系数矩阵进行SVR建模，对实际样品则扣除背景信号后进行SVR模型预测，以期建立一种基于不同添加剂类型的UV-KICA-SVR改进标准加入法的碳酸饮料中添加剂高通量筛查分析方法。

1 原理与算法

1.1 核独立成分分析

ICA[11-13]是一种统计信号处理技术, 目的是在信息损失最小的情况下, 将重叠多变量信号(重叠信号)分解为一组统计上独立的组分(源信号)。KICA是通过核函数将原始数据映射到高维特征空间后利用典型相关分析(CCA)，进一步提取得到与源信号对应的独立组分(IC)。由于核函数的引入，KICA进行化学信号处理时具有较强的稳健性。

1.2 支持向量回归分析

SVR算法的基本思想是通过一个非线性映射(核函数)，将原始数据映射到高维特征空间，并在这个空间建立回归模型。由于核函数的引入，SVR可以得到在常规空间难以得到的模型特征，既可用于线性过程建模，也能用于非线性过程建模[4-6]。

1.3 基于UV-KICA-SVR饮料样品中添加剂高通量筛查分析

模拟样品建模： 测试得到模拟混合样品UV数据，进行KICA解析得到IC及其系数矩阵，利用IC系数矩阵进行SVR建模，得到水性基质中添加剂测定的UV-KIVA-SVR定量模型。

实际样品测定： 加标饮料样品中UV光谱经KICA处理得到的IC信息，扣除其中待测添加剂以外基质信息，代入UV-KICA-SVR定量模型，预测得到加标饮料样品添加剂的预测量。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Thermo Accela, PDA detector, 1250 pump)： 由Thermo公司生产； TU-1901双光束紫外分光光度计： 由北京普析通用生产。

防腐剂与甜味剂： 对羟基苯甲酸甲酯钠(AR)，山梨酸钾(AR)，苯甲酸钠(AR)，阿斯巴甜(AR)，安赛蜜(AR)，糖精钠(AR)，甘草酸铵(AR)，均由天津市科密欧化学试剂有限公司生产。

饮料样品： 芬达，雪碧，醒目，由可口可乐公司生产。美年达，激浪，由百事可乐公司生产。

2.2 标准溶液与模拟溶液的配制

准确称取一定量的对羟基苯甲酸甲酯钠、山梨酸钾、苯甲酸钠等三种防腐剂，以及阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠、甘草酸铵等四种甜味剂，用蒸馏水溶解，制成0.1 g·L-1的标准工作液。准确移取适量标准工作液于50 mL容量瓶中，蒸馏水稀释定容至50 mL，分别按照正交设计表配制4水平、3因素、53次试验用防腐剂模拟样品系列与4水平、4因素、53次试验用的甜味剂模拟样品系列，添加剂最大含量水平为允许限量的4倍。

2.3 饮料样品及其加入标准品混合样的光谱测定

准确移取5 mL样品于50 mL容量瓶内，超声除去CO2气体。按表1和表2添加不同含量的防腐剂和甜味剂，用蒸馏水定容至50 mL。以蒸馏水作参比，使用1.0 cm比色皿测定其UV光谱，扫描间隔为1.0 nm，扫描波长范围190～400 nm。

Table 1 Different amount of preservatives adding into the beverages

Table 2 Different amount of sweeteners adding into the beverages

3 结果与讨论

3.1 单一防腐剂与甜味剂UV测定时的检出限

三种防腐剂及四种甜味剂的光谱吸收峰严重重叠，尤其是山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯钠的特征吸收峰几乎完全重叠，加之多种添加剂共存时其间还有可能以一定的方式结合等造成偏离比耳定律的现象发生，难以直接利用多元线性回归分析同时测定多种防腐剂和甜味剂含量。

分别在三种防腐剂与四种甜味剂的最大特征波长处进行回归分析，得到单一添加剂组分标准工作曲线。根据各回归方程及其回归标准偏差计算得到几种添加剂的检出限(LOD)分别为对羟基苯甲酸甲酯钠0.4 mg·L-1，山梨酸钾0.2 mg·L-1, 苯甲酸钠0.2 mg·L-1, 安赛蜜0.4 mg·L-1, 糖精钠1.0 mg·L-1, 阿斯巴甜0.8 mg·L-1, 甘草酸铵0.8 mg·L-1。

3.2 模拟水样中特征光谱轮廓提取与UV-KICA-SVR建模

3.2.1 模拟水样中纯组分UV轮廓的提取

采用主成分分析(PCA)确定防腐剂和甜味剂模拟混合样中吸光因子数均为3，分别用KICA提取其中IC得到3个UV轮廓如图1、图2所示。

将图1中IC数据矩阵与防腐剂纯组分光谱矩阵做相关性分析得到对应的相关系数(r)： IC1-对羟基苯甲酸甲酯钠，0.640 8； IC2-苯甲酸钠，0.856 9； IC3-山梨酸钾，0.960 0。说明KICA有效提取了模拟防腐剂水样中纯组分的UV光谱轮廓特征，混合组分IC可以作为样品定性分析。四种甜味剂模拟水样中仅有三种吸光因子数，原因是阿斯巴甜与糖精钠的在205～240 nm范围内光谱曲线变化趋势基本相同，只是在高吸收的近紫外(190～205 nm)有一定的差别，在240 nm以上UV波长范围基本上无吸收，此二者UV严重重叠，在KICA处理时将其作为同一IC[16-17]。

Fig.1 UV spectral profiles extracted from the simulated preservatives watefr solutions

Fig.2 UV spectral profiles extracted from the simulated sweeteners watefr solutions

图2中，3个IC与甜味剂数据矩阵的相关系数(r)分别为： IC1-甘草酸铵，0.965 4； IC2-安赛蜜，0.991 9； IC3-阿斯巴甜，0.893 8； IC3-和糖精钠，0.890 5。说明三种IC体现的四种甜味剂的UV光谱轮廓特征，其中IC3代表了阿斯巴甜与糖精钠UV光谱特征。

3.2.2 模拟水样UV-KICA-SVR建模

分别计算得到模拟防腐剂、甜味剂样品IC的系数矩阵各53组，均匀选取26组作为校正集，13组作为交互检验集，13组作为预测集。采用SVR建模，基于以往研究基础[10]，选择采用径向基核函数，设定σ=220，ε=0，γ=10×107。以交互检验均方根误差(RMSECV)、预测集均方根误差(RMSE)和预测值与实际值之间回线性归分析的相关系数来考查所建模型的性能和预测效果。结果表明，七种添加剂的RMSECV在0.009 8～0.074 8之间，RMSF在0.010 4～0.073 7之间，R2均大于0.99。检验集与和预测集的误差均较小且总体上大小相当，预测结果与实际加入量具有很好的线性相关性，说明建立即使在样品中样品光谱峰严重重叠、某些相似光谱成分视为相同IC的情况下，UV-KICA-SVR模型具有较好的准确性。

3.3 饮料中添加剂UV-KICA-SVR改进的标准加入法筛查

3.3.1 待测样品与背景信号的提取

采用KICA分别处理饮料中添加不同含量防腐剂、甜味剂样品的UV光谱数据，提取得到的IC信息分别如图3、图4所示。

Fig.3 Independent components extracted from beverages added different preservative levels

Fig.4 Independent components extracted from beverages added different sweetener levels

图3与图1对应的IC1，IC2，IC3相关系数分别为0.961 2，0.842 3，0. 879 0，IC4则体现为为背景信号； 图4与图2中对应的IC1，IC2，IC3相关系数分别为0.899 7，0.868 6，0.851 0，IC4则体现为为背景信号。分类建模时提取得到的样品背景信号IC4明显不同，说明标准加入法不同类型添加剂测定时的背景信号不同，在用SVR进行实际样品的含量预测时，将IC4图光谱信息扣除，即将其作为标准添加以外成分的背景信号，有效消除标准加入法背景信号的干扰。

3.3.2 饮料样品中防腐剂和甜味剂高通量筛查分析

分别计算扣除IC4背景信号后3个IC的系数矩阵，以此作为UV-KICA-SVR预测模型输入。市场上四种品牌碳酸饮料中防腐剂、甜味剂预测结果如表3所示。

Table 3 Regression equations between additives with different adding level and the predicted amounts by UV-KICA-SVR

Note:yPredicted amounts;x: Added mounts

由表3可以看出，添加量与预测量的回归方程的R2达到了0.99以上，说明所建立的UV-KICA-SVR在多种添加剂共存，同时还有其他基质成分存在的情况下，对实际饮料样品中待测成分具有良好的预测能力。当取添加量为0时，得到回归直线的截距，此值即饮料样品中相应的添加剂的含量(个别负值可作未检出处理)。回归方程的斜率为实际样品测定时的平均回收率[18]，可以看出同一饮料样品不同添加剂测定的回收率不同，不同样品中相同添加剂测定的回收率也不尽相同，说明待测成分与样品基质等对特定添加剂测定的回收率影响不同。

模型预测结果与采用HPLC测试结果进行了对比，对于饮料样品中防腐剂或甜味剂的阳性检出，UV-KICA-SVR法与HPLC法结果大体相当，误差不超过0.5 mg·L-1； 一些样品HPLC未检出防腐剂或甜味剂，采用本法预测出某些较低的含量，这些值低于本法的检测限，可作未检出或疑似阳性样品处理，必要时可以将样品进行浓缩净化等预处理后进一步确认。出现低于检测限的预测结果可能原因是部分防腐剂、甜味剂的UV光谱轮廓高度重叠，使得与其光谱特征相似的添加剂成分在SVR模型输入上形成部分投影而产生； 或者在与其他添加剂等成分共存时，由于协同效应[19]等因素，使得多元校正模型的预测能力较之于单一成分测定有所提高。

4 结 论

采用UV-KICA-SVR改进标准加入法分类建立校正模型，能够对实际饮料样品中的防腐剂、甜味剂含量进行预测。此法在实际样品分析时，能够得到样品中待测组分与其他背景成分的光谱轮廓特征，在进行SVR建模时可以扣除背景信号，从而对实际样品进行食品添加剂成分的定量筛查获得样品的定性或半定性信息。

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*Corresponding author

High Throughput Screening Analysis of Preservatives and Sweeteners in Carbonated Beverages Based on Improved Standard Addition Method

WANG Su-fang1, 2, LIU Yun1, GONG Li-hua1, DONG Chun-hong3, FU De-xue3, WANG Guo-qing1*

1. School of Materials and Chemical Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450001, China 2. Inspection & Quarantine Technology Centre, Henan Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau of China, Zhengzhou 450003, China 3. Research Center of Huaiqing Chinese Medicine, Jiaozuo University, Jiaozuo 454003, China

Simulated water samples of 3 kinds of preservatives and 4 kinds of sweeteners were formulated by using orthogonal design. Kernel independent component analysis (KICA) was used to process the UV spectra of the simulated water samples and the beverages added different amounts of the additive standards, then the independent components (ICs), i.e. the UV spectral profiles of the additives, and the ICs’ coefficient matrices were used to establish UV-KICA-SVR prediction model of the simulated preservatives and sweeteners solutions using support vector regression (SVR) analysis. The standards added beverages samples were obtained by adding different amounts level of additives in carbonated beverages, their UV spectra were processed by KICA, then IC information represented to the additives and other sample matrix were obtained, and the sample background can be deducted by removing the corresponding IC, other ICs’ coefficient matrices were used to estimate the amounts of the additives in the standard added beverage samples based on the UV-KICA-SVR model, while the intercept of linear regression equation of predicted amounts and the added amounts in the standard added samples is the additive content in the raw beverage sample. By utilization of chemometric “blind source separation” method for extracting IC information of the tested additives in the beverage and other sample matrix, and using SVR regression modeling to improve the traditional standard addition method, a new method was proposed for the screening of the preservatives and sweeteners in carbonated beverages. The proposed UV-KICA-SVR method can be used to determine 3 kinds of preservatives and 4 kinds of sweetener in the carbonate beverages with the limit of detection (LOD) are located with the range 0.2～1.0 mg·L-1, which are comparable to that of the traditional high performance liquid chromatographic (HPLC) method.

Independent component analysis; Support vector regression; Standard addition method; Preservative; Sweetener; Carbonate beverage

Aug. 31, 2014; accepted Dec. 16, 2014)

2014-08-31，

2014-12-16

国家自然科学基金项目(21075113)，国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2015IK114)和河南省基础与前沿技术研究项目(122300410004)资助

王素方，1966年生，河南出入境检验检疫局高级工程师 e-mail: wangsf@haciq.gov.cn *通讯联系人 e-mail: gqwang@zzuli.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0482-05