类胰岛素一号增长因子微球对成骨细胞功能的影响

张思慧， 陈小玲， 赵　欣

福建医科大学 附属口腔医院牙体牙髓二科，福州　350002



类胰岛素一号增长因子微球对成骨细胞功能的影响

张思慧， 陈小玲， 赵欣

福建医科大学 附属口腔医院牙体牙髓二科，福州350002

摘要:目的研究不同浓度类胰岛素一号增长因子(IGF-1)微球对成骨细胞功能的影响。方法缓释微球制作采用乳化冷凝聚合交联法；根据微球的药代动力学特性，将载不同浓度的IGF-1明胶微球分为0.25,2.5,25,250 ng/mg组及空白对照组，通过细胞增殖和分化实验评价不同浓度IGF-1微球对成骨细胞功能的影响。结果载不同浓度IGF-1的微球对细胞增殖的影响有显著性差异，0.25,2.5,25 ng/mg组对成骨细胞均具有显著的促增殖作用，其中25 ng/mg组的促增殖作用最为显著。载不同浓度IGF-1的微球对细胞分化的影响有显著性差异，其中25 ng/mg组的促分化作用最为显著。结论IGF-1明胶微球有显著促进成骨细胞增殖和分化的作用，其最佳浓度为25 ng/mg。

关键词:受体，类胰岛素一号增长因子； 明胶； 微球体； 成骨细胞； 细胞增殖； 细胞分化

类胰岛素一号增长因子(insulin-like growth factor 1, IGF-1)是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质，主要由成骨细胞分泌，具有促进Ⅰ型胶原的合成和成骨细胞分化以及保护骨基质的作用[1-2]。IGF-1可明显提高生物材料的生物活性，促进有丝分裂，刺激成骨细胞的增殖及胶原合成，促进骨折的愈合，且有时间和剂量依赖性[3-5]。有研究报道，IGF-1在0.1～10 ng/mL范围内，随着浓度增加，刺激成骨细胞的增殖作用逐渐增强，而浓度为10～100 ng/mL时，则无明显促增殖作用[6-8]。然而，各研究报道中IGF-1的浓度差异较大，且因IGF-1在体内很快扩散，易被蛋白酶分解，半衰期短等原因，目前尚未实现IGF-1的临床应用。为更好地利用IGF-1，保护生长因子活性，延长其作用时间，本研究采用乳化冷凝聚合交联法制作不同浓度的IGF-1缓释微球，用于促进体外培养的成骨细胞的增殖，明确IGF-1的最佳浓度，讨论载IGF-1缓释系统对成骨细胞功能的影响，现报道如下。

1材料和方法

1.1材料人成骨肉瘤成骨细胞MG63细胞(中南大学细胞中心)，明胶(美国Sigma公司)，IGF-1冻干粉剂(美国PeproTech公司)；酶标仪(上海永创医疗器械有限公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，台式低温高速离心机(德国艾本德公司)，激光衍射粒度分析仪(Mastersizer 2000型，英国马尔文公司)。

1.2方法

1.2.1IGF-1明胶微球的制备采用乳化冷凝聚合交联法制备的明胶微球粒径为10～40 μm，占80.25%，平均粒径为(20.33±3.67)μm，微球24 h内释药达到20%，随后速度减慢。将5 μL的5，50，500，5 000 ng/mL的IGF-1溶液加入1 mg干燥微球，即IGF-1明胶微球浓度为0.25，2.5，25，250 ng/mg。微球保存在pH为7.4的IGF-1溶液中，温度4 ℃，持续24 h，1 200～1 500 r/min速度下离心15 min，经双蒸水洗涤后利用冷冻干燥机冻干，经钴-60灭菌后保存。

1.2.2IGF-1微球的释药速率体外实验随机取0.25，2.5，25，250 ng/mg的IGF-1明胶微球2 mg，加入24孔细胞培养板，注入RPMI-1640培养基2 mL，培养箱中培养24 h，吸取摇匀浸提液，EP管中存放，4 ℃保存。每孔再加入2 mL RPMI-1640培养基，以同样方法留取2，4，6，8，10，12 d的浸提液，同法保存。按照ELISA法检测IGF-1释放速率，用酶联免疫仪在450 nm波长下测定上述保存液的OD值，与IGF-1标准曲线对照，计算出上述样本的IGF-1浓度，将每个时间点释放液的IGF-1含量分别加上前一时间点的IGF-1释放总量，得出该时间点的IGF-1释放总量，绘制IGF-1释放曲线。

1.2.3明确IGF-1微球有效浓度的细胞实验

1.2.3.1细胞培养实验生长期的MG63细胞利用0.25%胰酶消化，配制MG63悬液(5×104mL-1)，利用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基接种于无菌24孔板内。24 h后，倒置显微镜观察细胞贴壁且平铺于培养板内时，加入无菌IGF-1微球2 mg，分为5组：0.25，2.5，25，250 ng/mg组及空白对照组，每个样本设6个复孔，培养时间点为1，3，7，12 d，每个时间点均采用同样方法接种24孔培养板，轻吸上层培养液，置于无菌EP管中，4 ℃下保存。

1.2.3.2细胞增殖实验PBS缓冲液清洗每个时间点的24孔培养板3次，滴入5 mg/mL的四唑盐(MTT)，每孔150 μL，置于细胞培养箱中培养4 h，取培养板，加三联液(10%十二烷基硫代硫酸钠+5%异丁醇+12 mmol/L盐酸) 600 μL于24孔中，5 min后转移至96孔培养板中，利用酶标仪测定各孔在波长490 nm下的OD值。

1.2.3.3细胞分化实验在酶标包被板上设标准品孔10孔，试剂盒内标准品按说明书稀释，各孔加样量均为50 μL，取各个时间点无菌EP管中的培养液，设空缺孔(不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)及待测培养液孔。待测培养液孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL。用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，洗涤后加酶，显色，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min后终止。空缺孔调零，450 nm波长依序测量各孔的OD值。

2结果

2.1微球制作制备的IGF-1明胶缓释微球具有良好的分散性。扫描电镜下可见制备的明胶微球为表面光滑、粒径均匀的圆球(图1，2)。

2.2载不同浓度IGF-1明胶微球药代动力学特点载不同浓度IGF-1明胶微球初释速度较快，24 h内达到20%～30%左右，具有突释效应，3 d时IGF-1释放量约达40%，速度随时间增加而减缓，12 d时IGF-1累计释放率约为93%(图3)。

2.3测定IGF-1明胶微球有效浓度

2.3.1MG63细胞数量及形貌观察倒置显微镜下，细胞培养1 d后开始贴壁，触角未完全展开；3 d后各孔细胞贴壁完全，细胞数量较1 d时有所增加，形态呈多边形，触角伸展良好，各孔内差别不明显(图4)。

2.3.2不同浓度IGF-1明胶微球对MG63细胞增殖的影响MG63和不同浓度IGF-1明胶微球体外培养1，3，7，12 d后，通过MTT检测MG63细胞增殖，结果显示，不同浓度组在1，3，7，12 d时，组间比较差别均有统计学意义(P<0.05)，其中25 ng/mg组的细胞增殖结果最高，250 ng/mg组的细胞增殖结果最低(表1，图5A)。

2.3.3不同浓度IGF-1明胶微球对MG63细胞分化的影响不同浓度IGF-1明胶微球与MG63细胞体外培养1，3，7，12 d后，通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测成骨细胞分化功能,结果显示，不同浓度组间和不同时间点间的比较差别均有统计学意义(P<0.05)，其中25 ng/mg组的细胞分化结果最高，0 ng/mg组的细胞分化结果最低(表1，图5B)。

3讨论

本研究采用明胶微球作为IGF-1可控缓释系统，明胶是含有生物活性短肽的天然高分子生物材料，且生物相容性好。在明胶微球利用冷冻干燥机冻干过程中，与多肽形成氢键，形成稳定的多肽，利于细胞表面分子识别，具有保护IGF-1活性等优点[9]。丁红等制备阿奇霉素明胶微球，采用乳化化学交联法，对其分布及粒径、体外释放速率进行研究，证明明胶微球具有良好的可控缓释性能[10]。故本实验选择明胶微球作为可控缓释载体。有研究发现，IGF-1微球24 h内释药率达20%，随后速度减慢[11]。本研究显示，3 d后微球释药率约40%。

3.1IGF-1微球浓度分组IGF-1的有效应用浓度和对成骨细胞增殖及分化的作用目前尚不明确[12-13]。一般认为，IGF-1呈剂量、时间依赖性增强骨源性间充质细胞向软骨分化，一定浓度范围内的IGF-1可促进细胞增殖，而高浓度的IGF-1对细胞增殖无明显作用，甚至可能对细胞增殖起抑制作用[14]。有研究报道，IGF-1在0.1～10 ng/mL范围内时，随着浓度的增加，可刺激成骨细胞的增殖；浓度为10～100 ng/mL时，则无明显促增殖作用。研究报道中,IGF-1浓度差异较大，本研究中，3 d微球释药率约40%，为维持IGF-1有效浓度在0.1～100 ng/mL范围内，本研究将5 μL的5，50，500，5 000 ng/mL的IGF-1溶液加入1 mg干燥微球[10-11]，即IGF-1明胶微球浓度分别为0.25，2.5，25，250 ng/mg。

IGF-1：类胰岛素一号增长因子.与0 ng/mg组比较，☆：P<0.05；与0.25 ng/mg组比较，Δ：P<0.05；与2.5 ng/mg组比较，▲：P<0.05；与25 ng/mg组比较，●：P<0.05.

3.2不同浓度IGF-1明胶微球对MG63细胞增殖的影响2.5～25 ng/mg的IGF-1明胶微球均可促进MG63细胞增殖，且呈剂量正效应关系，25 ng/mg浓度时促增殖分化作用最强。分析原因：IGF-1与骨骼IGF-1受体结合使胰岛素受体底物磷酸化，激活PI3K依赖的AKT，促进成骨细胞增殖和存活。但是,细胞膜表面Fas表达也同时增加，而Fas介导成骨细胞凋亡，即IGF-1可同时调节成骨破骨过程，进而影响骨改建和骨形成。250 ng/mg的IGF-1在促进成骨细胞增殖的同时，有可能加剧破骨细胞的活动增强，导致增殖作用受到抑制[15-16]。

3.3不同浓度IGF-1明胶微球对MG63细胞分化的影响IGF-1促进成骨细胞增殖的同时可抑制其凋亡，并使其早期就进入分化阶段，250 ng/mg IGF-1的明胶微球对MG63细胞ALP活性的影响与它对细胞增殖的作用恰恰相反，提示成骨细胞增殖和分化过程可能是两个独立进行的过程，这对于骨组织修复和骨形成意义重大[17]。本研究结果与许多报道并未完全一致，原因可能是各实验中所使用的IGF-1浓度、MG63细胞来源和细胞密度不同。

本研究结果提示，载有2.5～25 ng/mg IGF-1的明胶微球能有效促进成骨细胞的增殖和分化，且呈浓度依赖，最佳浓度为25 ng/mg，但其在临床上的应用仍有待进一步研究。

参考文献：

[1]Martel-Pelletier J, Di Battista J A, Lajeunesse D,etal. IGF/IGFBP axis in cartilage and bone in osteoarthritis pathogenesis[J].InflammRes, 479(3):90-100.

[2]Clarke S A, Brooks R A, Lee P T,etal. The effect of osteogenic growth factors on bone growth into aceramic-filled defect around an implant[J].BoneJointSurgBr, 2004,22(5):1016-1024.

[3]Raschke M, Wildemann B, Inden P,etal. Insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-β1accelerates osteotomy healing using polylactide-coated implants as a delivery system: a biomechanical and histological study in minipigs[J].Bone, 2002,30(1):144-151.

[4]Schmidmaier G, Wildemann B, Heeger J,etal. Improvement of fracture healing by systemic administration of growth hormone and local application of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-β1[J].Bone, 2002,31(1):165-172.

[5]Matilda H C, Sheng K H, William L,etal. Role of osteocyte-derived insulin-like growth factor 1 in developmental growth, modeling, remodeling, and regeneration of the bone[J].BoneMetab, 2014,219(1):41-54.

[6]贺捷, 陈万涛, 万澎波, 等. 纳米氧化钛薄膜对颅成骨细胞黏附、增殖的影响[J]. 口腔医学, 2007,27(9):449-451.

[7]Sato M, Webster T J. Nanobiotechnology: implications for the future of nanotechnology in orthopedic applications[J].ExpertRevMedDevices, 2004,1(1):105-114.

[8]Meirelles L, Melin L, Peltola T,etal. Effect of hydroxyapatite and titania nanostructures on earlyinvivobone response[J].ClinImplantDentRelatRes, 2008,10(4):245-254.

[9]Rita C, Elisabetta E, Maria O. Dextran cross-linked gelatin microspheres ag adrug delivery system[J].EuropeanPharmandBiopharm, 1999, 47(2):153-160.

[10]丁红, 邢桂琴, 谢茵. 阿霉素明胶微球的制备与特性研究[J]. 中国医院药学杂志, 2000,20(7):387-389.

[11]陈良建, 袁剑明, 李益民, 等. 多孔钛植入体表层孔隙内TGF-β1缓释明胶微球涂层的工艺优化[J]. 中南大学学报, 2009,40(5):1228-1234.

[12]徐萍, 张克勤, 刘超, 等. 重组人胰岛素样生长因子对大鼠细胞增殖、调亡及型胶原蛋白合成的影响[J]. 中国骨质疏松杂志, 2006,12(1):17-21.

[13]Jia D A, Heersche J N M. Insulin-like growth factor-1 and 2 stimulate osteoprogenitor proliferation and differentiation and adipocyte formation in cell populations derived from adult rat bone[J].Bone, 2000,6:785-794.

[14]Puckett S, Pareta R, Webster T J. Nano rough micron patterned titanium for directing osteoblast morphology and adhension[J].IntJNanomedicine, 2008,3(2):229-241.

[15]Plachokova A S, van den Dolder J, Stoelinga P J,etal. The bone regenerative effect of platelet-rich plasma in combination with an osteoconductive material in rat cranial defects[J].ClinOralImplantsRes, 2006,17 (3):305-311.

[16]陈卓凡. 口腔种植治疗的基础研究与临床应用[M]. 北京:人民军医出版社, 2010:21.

[17]Clarke S A, Brooks R A, Lee P T,etal. Bone growth into aceramic-filled defect around an implant. The response to transforming growth factor beta1[J].JBoneJointSurgBr, 2004,86(1):126.

(编辑：何佳凤)

The Effects of Gelatine Microspheres Loading with Different Concentrations of IGF-1 on the Function of Osteoblast Cells

ZHANG Sihui, CHEN Xiaoling, ZHAO Xin

Department II of Endodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China

ABSTRACT:ObjectiveTo evaluate the effects of gelatin microspheres loaded with different concentrations of IGF-1 on the function of osteoblast cells in vitro.MethodsThe improved emulsified cold condensation method was employed to fabricate the gelatin microspheres loaded with following five concentration groups of IGF-1: 0.25, 2.5, 25, 250, 0 (negative control) ng/mg.The effects of loaded gelatin microspheres on proliferation and differentiation of MG63 were then checked in vitro.ResultSignificant different effects of gelatin microspheres loaded with different concentrations of IGF-1 on osteoblast cells’ proliferation were evident.The proliferation amount of the cells was in the following order: group 25 ng/mg>group 2.5 ng/mg>group 0.25 ng/mg>group 0 ng/mg>group 250 ng/mg(P<0.05).Similarly, significant different effects on osteoblast cells’ differentiation were found in the following fashion: alkaline phosphatase(ALP) in group 25 ng/mg>groups 2.5, 250 and 0.25 ng/mg>group 0 ng/mg(P<0.05).ConclusionGelatin microspheres loading with IGF-1 had positive effects on the function of osteoblast cells.The preferred concentration of IGF-1 on the gelatin microspheres is 25 ng/mg.

KEY WORDS:receptor, IGF type 1; gelatin; microspheres; osteoblasts; cell proliferation; cell differentiation

收稿日期:2015-08-31

基金项目:福建省教育厅B类项目(JB12128)

作者简介:张思慧(1983-)，女，住院医师，医学硕士. Email: zshfmu@sina.com

中图分类号:R329.24； R94； R963； R977.6

文献标志码:A

文章编号:1672-4194(2016)01-0015-05