灵芝三萜组分增强紫杉醇诱导HER2+乳腺癌细胞凋亡的研究

张志强， 夏　笠， 熊小文， 李　日韦， 李　鹏， 许建华

福建医科大学 药学院，福州　350108



灵芝三萜组分增强紫杉醇诱导HER2+乳腺癌细胞凋亡的研究

张志强， 夏笠， 熊小文， 李日韦， 李鹏， 许建华

福建医科大学 药学院，福州350108

摘要:目的探讨灵芝三萜组分(GLE)增强紫杉醇(PTX)诱导人表皮生长因子受体2阳性(HER2+)乳腺癌细胞凋亡的作用和机制。方法磺酰罗丹明B(SRB)法和台盼蓝染色计数法检测细胞增殖活性。CompuSyn软件分析药物相互作用。免疫印迹法检测蛋白表达。采用人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型研究体内抗肿瘤作用。结果体外实验表明，GLE与PTX协同抑制SKBR-3细胞的增殖和诱导细胞凋亡，并协同诱导细胞凋亡相关蛋白的表达和阻断HER2信号通路的传导。体内动物实验表明，GLE增强PTX抗HER2+乳腺癌的作用。结论GLE与PTX在体内外对HER2+乳腺癌SKBR-3细胞具有协同抑制作用。

关键词:灵芝； 三萜类； 紫杉酚； 乳腺肿瘤； 细胞凋亡； 协同

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是获得美国食品药品监督管理局批准用于治疗卵巢癌、乳腺癌和肺癌等多种肿瘤的有效药物，其作用机制是通过诱导和促进微管蛋白聚合，抑制细胞分裂和纺锤体的形成，导致肿瘤细胞死亡，从而发挥抗肿瘤作用[1-2]。人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)属于酪氨酸激酶受体的ErbB家族的一个成员，在人乳腺癌中约有20%～30%存在过表达[1-3]。PTX是治疗晚期乳腺癌的一线化疗方案的重要组成成分之一，但是PTX具有严重的副作用，如免疫抑制、神经毒性等。目前主要采用结构修饰、改进剂型、联合用药等途径提高PTX疗效，降低不良反应[3]。灵芝三萜组分(ganoderma lucidum extract, GLE)具有抗肿瘤活性[4]，本文研究GLE增强PTX诱导HER2+乳腺癌细胞SKBR-3凋亡的作用和机制，为GLE应用于乳腺癌的辅助治疗提供一些实验和理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康BALB/c裸鼠(18±2)g，SPF级[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号:SCXK(沪)2012-0002]。

1.1.2材料GLE由福建医科大学药学院李鹏副教授提取并纯化。磺酰罗丹明B (sulforhodamine B，SRB，批号230162，美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，批号1108223，上海国药集团化学试剂有限公司)；RPMI 1640培养基(批号1247076，美国Gibco公司)；胎牛血清(批号140506，杭州四季青生物工程材料有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞株SKBR-3培养于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中。细胞置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞增殖活性的测定

1.2.2.1SRB法参照文献[5]，实验设对照组及不同浓度加药组，每组设3个复孔，实验重复3次，计算半抑制浓度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.2.2.2台盼兰染色计数法将细胞用药物处理后制成细胞悬液，与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合均匀，并在显微镜下计数活细胞和死亡细胞。

1.2.3细胞凋亡的检测收集药物处理后的SKBR-3细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次后，用含有5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI的Binding Buffer避光孵育15 min，通过流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

1.2.4免疫印迹分析提取药物处理后的细胞总蛋白并定量。将等量的蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转印至聚偏二氟乙烯膜，加入封闭液室温封闭1 h后，与一抗孵育4 ℃过夜。随后用洗涤缓冲液洗涤3次，与二抗室温孵育2 h，再用洗涤缓冲液洗涤3次后，加入化学发光剂显影、拍照。

1.2.5体内抑瘤实验取对数生长期的SKBR-3细胞，按照每只裸鼠接种2×107个细胞/0.2 mL生理盐水于右前肢皮下。待瘤体积长至2 000 mm3左右时，再将瘤块切成体积大致相等的小瘤块接种至24只裸鼠右前肢皮下。待瘤体积长至35 mm3左右时，将裸鼠按瘤体积大小随机分成4组，每组6只，分别为：(1)对照组；(2)PTX给药组(5 mg/kg，静脉注射，q3d×5)；(3)GLE给药组(250 mg/kg，口服，qd×14)；(4)联合给药组(GLE+PTX)。每3天用游标卡尺测量裸鼠瘤块最长径L(mm)和最短径W(mm)，并记录裸鼠体质量，计算公式如下：

瘤体积(mm3)=0.5×L×W2

抑瘤率(%)=[对照组瘤质量(g)-给药组瘤质量(g)]×100%/对照组瘤质量(g)

2结果

2.1GLE和PTX抑制SKBR-3细胞的增殖GLE作用24，48和72 h后的IC50分别为(38.96±4.10)，(23.95±3.50)和(17.13±3.09)μg/mL，呈现明显的时间和浓度依赖性(图1)。PTX作用24，48和72 h后的IC50分别为(2.76±0.28)，(1.86±0.32)和(1.45±0.02) ng/mL(图1)。根据其作用24 h后对细胞增殖抑制的IC50，分别将25 μg/mL和2.0 ng/mL作为研究GLE 和PTX是否具有协同抑制SKBR-3细胞增殖作用的浓度。

2.2PTX与GLE协同抑制SKBR-3细胞的增殖台盼蓝拒染法结果表明，作用24 h后GLE(25 μg/mL)和PTX(2 ng/mL)对SKBR-3细胞的增殖抑制率分别为3.17%和15.8%，两者联合用药后则可提高至31.68%(图2)。

为进一步研究协同效果，分别将GLE和PTX的浓度降至原来的一半，再通过协同分析软件CompuSyn分别研究固定浓度比例(12 500∶1)的GLE和PTX联合作用SKBR-3细胞24，48和72 h后的协同效果。结果表明，GLE和PTX在24，48和72 h的联合指数(combination index，CI)分别为(0.847±0.222)，(0.827±0.042)和(0.601±0.118)。

2.3GLE和PTX协同诱导SKBR-3细胞凋亡流式细胞仪分析细胞凋亡结果表明，作用SKBR-3细胞24 h后，GLE(25 μg/mL)和PTX(2 ng/mL)诱导细胞的凋亡率分别为10.5%和15.6%，两者联合作用后为28.3%，而对照组为6%(图3)。

2.4GLE和PTX协同增强对HER2和凋亡相关信号通路的影响免疫印迹结果显示，作用SKBR-3细胞24 h后，GLE(25 μg/mL)对HER2和凋亡相关信号通路的影响较小，PTX(2 ng/mL)则对这些信号通路有一定的影响，但是两者联合作用后能够显著抑制细胞HER2信号通路的活化和激活线粒体凋亡途径(图4)。

2.5GLE增强PTX体内抗SKBR-3乳腺癌的作用SKBR-3细胞裸鼠移植瘤实验结果表明，治疗结束后，与对照组比较，PTX(5 mg/kg，q3d×5，静脉注射)和GLE(250 mg/kg，qd×14，口服)单独给药组的抑瘤率分别为28.5%和19.4%，而联合用药组的抑瘤率则提高至48.4%，显示很好的协同抗HER2+乳腺癌的效果(图5)。

3讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，对女性身心健康有严重影响甚至威胁生命[6]。研究表明，HER2的过表达与这些细胞的恶性特征相关，包括侵袭、转移能力和对化疗药物的抗性等。HER2基因扩增可以作为乳腺癌预后差的一个独立评估因子，不论淋巴结是否阳性，HER2阳性的乳腺癌患者术后复发风险远高于其他人群[7]。HER2通过形成同源或者和家族中其他成员形成异源二聚体，导致其胞内尾部的酪氨酸残基磷酸化而被激活，进而激活PI3K-AKT、MAPK等多条信号通路，刺激乳腺癌细胞增殖。PTX是临床上治疗乳腺癌的一线化疗药物，但是肿瘤细胞对PTX容易产生耐药性，这是导致临床上化疗失败的重要原因之一[8]。此外，研究表明HER2的过表达还会降低PTX的药物敏感性[9]。为了提高PTX等化疗药物的临床疗效，亟需研发更为有效的治疗策略。研究表明，通过针对肿瘤发生发展不同阶段的多个靶点而使用作用机制不同的药物进行联合治疗癌症的策略显示出明显的优越性[10-11]。从中草药中寻找低毒、高效的抗肿瘤活性成分成为当今抗肿瘤药物发展战略的重点之一[12]。

灵芝为多孔菌科(polyproraceae)灵芝属(Ganoderma)真菌植物赤芝(Ganodermalucidum)的干燥子实体[13]。灵芝性温、味甘，多分布于闽、云、贵、冀、吉、苏、浙等省，在我国已经有悠久的药用历史，始载于《神农本草经》，具有补中益气、滋补强壮、扶正固本之功效，是一种珍贵的中药材。灵芝能够增强机体的免疫力，对人体的毒副作用小，是传统的抗肿瘤和辅助药物。

前期研究显示，GLE是灵芝抗肿瘤的活性部位[4]。本研究通过SRB法检测细胞增殖活性的结果表明，GLE可以明显增强PTX抑制SKBR-3细胞增殖的作用，并具有时间和剂量依赖性。分析结果显示，PTX与SKBR-3联合用药具有协同效果。通过台盼蓝拒染法计数结果也显示，GLE和PTX联合用药比单独用药抑制细胞增殖的效果好。细胞凋亡是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程的一种自我调节机制，它涉及到一系列信号级联反应。免疫印迹和流式细胞检测结果显示，GLE可通过增强PTX抑制HER2信号通路的活化和激活线粒体凋亡途径来诱导SKBR-3细胞凋亡。SKBR-3荷瘤裸鼠实验结果表明，GLE可以明显增强PTX体内抗HER2+乳腺癌的作用。尤其值得注意的是，GLE和PTX联合用药并没有显示出明显的毒性。因此，本研究结果表明，GLE在体内外可以增强PTX抗HER2+乳腺癌的活性，其机制与抑制HER2+信号通路和激活线粒体凋亡途径有关，提示GLE与PTX联合用药对HER2+乳腺癌可能是一种安全有效的治疗方案，为GLE应用于抗HER2+乳腺癌治疗提供了实验和理论依据。

参考文献：

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[2]吴秀兰,贾艳,朱波,等. 天然抗癌药物紫杉醇的研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2014,33(5):42-45.

[3]张龙,王凤玮. 紫杉醇用于乳腺癌治疗的应用进展[J]. 中国医药导报,2014,11(31):167-168.

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[5]Vichai V, Kirtikara K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening[J].NatureProtocols,2006,1(3):1112-1116.

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[12]Darocha A B, Lopes R M, Schwartsmann G. Natural products in anticancer therapy[J].CurrentOpinioninPharmacology,2001,1(4):364-369.

[13]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京:中国医药科技出版社,2010：174.

(编辑:张慧茹)

Enhancement of Paclitaxel Induced Apoptosis in HER2+Breast Cancer Cells by the Triterpene Component of Ganoderma Lucidum

ZHANG Zhiqiang, XIA Li, XIONG Xiaowen, LI WEI, LI Peng, XU Jianhua

School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108

ABSTRACT:ObjectiveTo study the enhancement effect of paclitaxel (PTX) induced apoptosis in HER2+ breast cancer cells by the triterpene component of Ganoderma lucidum (GLE) and its mechanism.MethodsCell proliferation was analyzed by SRB and trypan blue exclusion staining method.The expression of proteins was detected by Western blot.Antitumor activity in vivo was studied in SKBR-3 xenograft model.ResultsIn vitro, GLE and PTX had synergistic effect on the proliferation and induced apoptosis in SKBR-3 cells, and on the upregulation of proteins related to cell apoptosis and blocking transduction of HER2 signaling pathway.In vivo, GLE enhanced antitumor activity of PTX against HER2+ breast cancer.ConclusionGLE and PTX have synergistic antitumor effect against the HER2+ breast cancer cells SKBR-3 both in vitro and in vivo.

KEY WORDS:Ganoderma lucidum； triterpenes； paclitaxel； breast neoplasms； apoptosis； coordinative theory

收稿日期:2015-10-08

基金项目:福建省自然科学基金(2015J01678)；福建省自然科学基金青年项目(2010J05068)；福建省高校杰出青年科研人才培育计划(JA13133)；福建省中青年教师教育科研基金资助项目(JA13151)；华南肿瘤学国家重点实验室开放基金(HN2015-05)

作者简介:张志强(1975-)，男，助理研究员，医学博士通讯作者: 许建华.Email:xjh@fjmu.edu.cn

中图分类号:R282.71； R737.9； R916.4

文献标志码:A

文章编号:1672-4194(2016)01-0001-05