构建Diquat诱导断奶仔猪氧化应激模型的研究

刘 通，李泽青，闫 峻，李 宁，穆淑琴，李 驰，马 墉，王文杰

1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.天津市宝坻区畜牧水产业发展服务中心；3.天津市畜牧兽医研究所；4.天津市畜禽健康养殖技术工程中心

构建Diquat诱导断奶仔猪氧化应激模型的研究

刘 通1，李泽青2，闫 峻3,4,*，李 宁1，穆淑琴3,4，李 驰1，马 墉3,4，王文杰3,4

1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.天津市宝坻区畜牧水产业发展服务中心；3.天津市畜牧兽医研究所；4.天津市畜禽健康养殖技术工程中心

试验通过观察断奶仔猪一次性腹腔注射Diquat后生长性能、血液生化及抗氧化指标的变化，验证氧化应激模型是否构建成功，并进一步探明用来评价氧化应激的敏感指标。选用DLY断奶仔猪10头，体重10.64±1.08 kg，随机分配到2个组中，每组5个重复，每个重复1头猪。处理组按体重一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液，对照组腹腔注射相同剂量的灭菌生理盐水。试验期21 d，在试验第3、10、21天空腹前腔静脉采血，检测血清生化及抗氧化指标。结果表明，Diquat显著降低仔猪ADG和ADFI(\%P\%<0.01)，显著提高血液中ALT、AST活性和COR含量(\%P\%<0.05)，显著降低血液中GSH-Px活力(\%P\%<0.05)。试验表明，一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可以诱导断奶仔猪氧化应激，应激效应可持续21 d以上，血液中ALT、AST、GSH-PX活力以及COR含量可作为评价氧化应激的指标。

Diquat；断奶仔猪；氧化应激；模型

The Construction Method of Diquat Induced Oxidative Stress Model of Weaned Pigs

氧化应激是指当动物受到各种有害刺激时，机体内高活性分子物质如活性氧自由基和活性氮自由基过量产生，氧化程度超出氧化物的清除，机体处于过氧化损伤的一种状态。出生、断奶、环境等多种因素均可诱导畜禽体内产生氧化应激。生产过程中，氧化应激极大降低了畜禽的生产性能和免疫力，进而引发疾病，给养殖业带来巨大损失。为深入研究氧化应激的机制及抗应激措施，建立稳定的氧化应激模型非常重要。Diquat 是二吡啶基除草剂，有研究表明，Diquat能利用分子氧产生O2-和H2O2，其诱导产生氧化应激程度取决于剂量和次数，易于操作和控制，可作为构建氧化应激的诱导物。本试验通过给断奶仔猪一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液，考察氧化应激的持续时间和血液敏感指标变化，构建稳定的仔猪氧化应激模型。

1 材料与方法

1.1 材料

Diquat(水剂，有效成分20%)购于河北荣威生物药业有限公司 。

1.2 试验动物及处理

选取健康、体重相近(10.60±1.10 kg)杜×长×大三元杂交断奶仔猪30头(公母各半)，随机分为2个处理组，每个处理3重复，每重复5头猪。对照组每头猪腹腔注射2 mL灭菌生理盐水，处理组每头猪一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液2 mL。

1.3 试验饲粮

基础日粮参考NRC (2012)10～20 kg仔猪营养需要配制，组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础) %

组成(%)营养水平玉米豆粕(46%CP)膨化豆粕乳清粉鱼粉蔗糖玉米油石粉磷酸氢钙食盐胆碱多维*多矿〔合计60.0011.0015.005.004.002.000.500.800.850.200.100.050.50100粗蛋白CP(%)赖氨酸(%)钙(%)总磷(%)消化能(MJ/kg)---------18.731.160.950.5113.95---------

*每kg配合饲料提供Supplied the followings per kg of diets：VA10 000 IU：VD32 000 IU；VE100 IU；VK32 mg；VB12 mg；VB26 mg；VB1212 μg；Niacin 30 mg；Folic acid 0.7 mg；D-pantothenic acid 15 mg；Biotin 0.5 mg；Fe 100 mg；Cu 40 mg；Zn 100 mg；Mn 30 mg；Se 0.3 mg；I 0.2 mg。(消化能为计算值，其余为测定值)。

1.4 饲养管理

试验猪在保育舍饲养，粉料饲喂，自由采食和饮水，试验期为21 d。按常规饲养管理方法进行。分别于试验开始和结束时空腹称重，记录每头猪体重；在第3、10、21天，全部试验猪空腹前腔静脉采血5 mL，制备血清，-20℃保存待检。

1.5 指标检测与方法

1.5.1 生长性能 记录每天饲料消耗量，计算全期的ADG(平均日增重)、ADFI(平均日采食量)和F/G(料重比)。

1.5.2 血液生化指标的测定方法 总蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、葡萄糖(Glucose，GLU)使用东芝120生化检测仪检测；皮质醇(Cortisol，COR)、白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)使用XH6080放免仪检测；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；免疫球蛋白A、G、M试剂盒购自北京金海科隅生物科技发展有限公司。

1.6 数据分析与处理

数据采用SPSS 20.0软件的ONE-WAY 单因素方差分析，以Duncan氏法进行组间多重比较，\%P\%<0.05为差异显著。结果使用平均值±标准差表示。

2 试验结果与分析

2.1 Diquat对断奶仔猪生产性能的影响

从表2可以看出，与对照组相比，处理组的ADFI和ADG显著降低(\%P\%<0.05)， F/G有提高趋势但差异不显著(\%P\%>0.05)。

表2 Diquat对断奶仔猪生产性能的影响

注：同行数据肩标不同的小写字母表示差异显著(\%P<\%0.05)，相同或无字母表示差异不显著(\%P>\%0.05)。下表同。

2.2 Diquat对仔猪血液生化指标的影响

由表3可以看出，注射后第3天对照组和处理组间血液ALT、AST无显著差异(\%P>\%0.05)；注射后第10天试验组血液ALT、AST提高了17.71%和15.54%；注射后第21天，处理组血液ALT、AST显著高于对照组(\%P<\%0.05)。

2.3 Diquat对仔猪血液氧化指标的影响

从表4可以看出，试验第3、10、21 d，处理组血液COR含量均显著高于对照组(\%P<\%0.05)，血液GSH-Px均显著低于对照组(\%P<\%0.05)。

表3 Diquat对仔猪血液生化指标的影响

表4 Diquat对仔猪血液氧化指标的影响

3 讨论

3.1 Diquat对仔猪生长性能的影响

消化道是动物消化、吸收和代谢的主要器官，在氧化应激状态下，细胞内产生大量的自由基，破坏生物膜，影响细胞的正常生理功能，诱发消化道疾病，致使消化道腺体分泌异常、肠道损伤及肠粘膜通透性升高和肠源性感染，动物表现出采食量下降，生产性能降低。研究发现，氧化应激通过破坏细胞之间的紧密连接，引起水和大量离子由肠黏膜进入肠腔内，诱发腹泻。本试验研究发现，注射Diquat 30 min后所有试验猪出现呕吐、腹泻的症状，三天后基本恢复正常，氧化应激显著降低了仔猪的ADFI和ADG，降低了仔猪的生长性能。

3.2 Diquat对血液生化指标的影响

Diquat的靶器官是动物肝脏。血液ALT 、AST的水平反映肝细胞的损伤程度。当肝细胞受到损伤或发生病变时，细胞的结构和功能完整性遭到破坏，其内部的ALT、AST释放并大量进入血液，引起血液ALT、AST 含量升高，而肝脏组织中两种酶的活性下降，因此血液中ALT、AST升高可作为肝脏功能受损或病变的敏感指标。王转丁等研究发现，游泳应激30 min、50 min 后小鼠血液ALT 和AST显著升高，之后有所下降但仍高于游泳前水平，说明游泳应激可能造成小鼠肝脏损伤，血液ALT和AST可作为评价小鼠应对游泳应激的敏感指标。本试验与上述研究结果一致，Diquat显著提高了血液ALT和AST水平，对仔猪肝脏造成了损伤，造成氧化应激。而试验前期ALT、AST均处于一个较高水平且差异不显著，这可能与仔猪断奶应激有关，朱梦玲等研究表明，仔猪断奶后血液ALT、AST水平显著升高，试验中后期ALT、AST活性呈现下降趋势，说明仔猪逐渐适应断奶应激。

3.3 Diquat对血液抗氧化指标的影响

GSH-Px是动物体内的天然自由基清除剂，可以催化H2O2和脂质过氧化物还原，在抗氧化损伤和维持细胞的结构方面起着重要的作用。刘晓慧等研究发现，小鼠巨噬细胞氧化损伤模型中GSH-Px活性显著低于正常细胞。COR是由肾上腺皮质分泌的一种糖皮质激素，主要作用是调节体内糖和蛋白质的代谢。马文涛等研究表明，应激组大鼠血清COR含量显著高于对照组。本试验结果表明，Diquat能显著降低GSH-Px活性，增加血液COR含量，降低了仔猪抗氧化能力，使仔猪处于氧化应激状态。

3.4 Diquat诱导的仔猪氧化应激模型

本试验综合仔猪生产性能、血液生化指标可知，通过一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可有效诱导仔猪发生氧化应激，建立稳定的氧化应激模型。袁施彬等研究发现，给仔猪一次性腹腔注射12 mg/kg Diquat溶液后第49 d的血清抗氧化酶活力及免疫指标仍显著低于对照组，表明应激持续了49 d。徐静等研究表明，给生长猪一次性腹腔注射8 mg/kg Diquat溶液后氧化应激效应可持续约28 d，到第35 d时，应激效应基本消除。本试验中，仔猪在注射Diquat后的3周内均处于氧化应激状态，说明应激效应时间可持续21 d以上。

4 结论

给断奶仔猪一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可诱导氧化应激，建立仔猪氧化应激模型，应激效应可持续21d以上；血清中ALT、AST、GSH-Px和COR可作为评价氧化应激的敏感指标。

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LIU Tong1, LI Ze-qing2, YAN Jun3,4,*, LI Ning1, MU Shu-qin3,4, LI Chi1,

MA Yong3,4, WANG Wen-jie3,4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnologyNorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2TianjinBaodiDevelopmentServicecenterofLivestockandAquaculture,Tianjin301800; 3.TianjinInstituteofAnimalhusbandryandveterinary,Tianjin300381,China; 4.TianjinTechnologyEngineeringCenterofLivestockandPoultryhealthyhusbandry,Xiqing,Tianjin300381,China)

This study was to observing growth performance, serum biochemical and antioxidant level of weaned pigs after intraperitoneal injected Diquat, verify whether oxidative stress model was successfully constructed and further evaluate sensitive indicator of oxidative stress.Thirty 10.60±1.10 kg weaned pigs were randomized in two groups, each group has 3 replicates with 5 piglet, the treated group intraperitoneal injected Diquat 10 mg/kg, the control group was injected with the same dose of sterile saline.Trial period 21d, in the 3, 10, 21 days of fasting before venous blood sampling and test serum biochemical and antioxidant indices.The results showed that, Diquat significantly reduce pig’s ADG and ADFI (\%P\%<0.05), significantly increased serum ALT, AST activity and COR level (\%P\%<0.05), significantly reduce serum GSH-Px vitality (\%P\%<0.05).The study showed that intraperitoneal injection of 10 mg/kg Diquat in weaned pigs can induce oxidative stress, stress reaction can retain 21d above, serum ALT, AST, GSH-PX vitality and COR levels can be as stress-sensitive indicators.

Diquat; weaned piglets; oxidative stress; model

2016-08-29

十二五农村领域国家科技计划(2012BAD39B01-3)；博士后基金(2014M561191)；天津市农科院院长基金 (15001)。

刘通(1992-)，男，辽宁大连人，硕士，主要从事动物营养研究。E-mail:173148612@qq.com。

*[通讯作者] 闫峻(1984-)，江苏徐州人，博士，主要从事单胃动物营养与健康养殖技术研究。E-mail:yjjsxz@163.com。

S 828.8

A

1004-6704(2016)06-0061-03