梅花鹿大肠杆菌的分离与鉴定

宋得华

定西市临洮农校，甘肃 定西 730500

梅花鹿大肠杆菌的分离与鉴定

宋得华

定西市临洮农校，甘肃 定西 730500

本试验采集武威市天祝县某养殖场病死梅花鹿病料，经细菌分离培养、细菌形态观察、培养特性、生化特性鉴定、药敏试验及致病性检测，初步确定致病菌种。对已分离经纯培养的菌株提取基因组DNA，利用引物进行PCR扩增，并得到预期的基因片段。切下目的条带分别进行回收、载体与产物的连接转化，最后挑取阳性斑置于LB肉汤中，送生物公司测序后，结合细菌学试验结果最终确定该梅花鹿死亡是由大肠杆菌引起，在此基础上提出综合性的防治措施。

梅花鹿；大肠杆菌；分离；鉴定

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 武威市天祝县某养殖场病死梅花鹿内脏组织。

1.1.2 试验设备 MOTIC B SERIES光学显微镜、DHP-9270B恒温培养箱、温度梯度基因扩增仪、高速冷冻离心机、恒温鼓风干燥箱、DYY-11B型三恒电泳仪、干式恒温器(DC10)。

1.1.3 试验试剂 琼脂粉、SS琼脂、麦康凯琼脂、生化反应所需试剂、引物、OMEGA D3350-01基因组提取试剂盒、Promega胶回收试剂盒、JM109感受态细胞、pGEM-T载体等。

1.1.4 试验药品 麦迪霉素、阿米卡星、米诺环素、左氧氟沙星、克林霉素、氨曲南、头孢西丁、头孢哌酮药敏纸片。

1.1.5 试验动物 Balb/c小鼠8只，由兰州大学医学院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 病料涂片染色 采取病死梅花鹿肝、肺涂片，革兰氏染色镜检，在各脏器中均能见到革兰氏阴性短杆菌。悬滴法检查运动力，运动力活泼。

1.2.2 分离培养 采取病死梅花鹿肝、肺分别接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美兰琼脂平板、血琼脂平板，置37℃温箱培养24 h。从普通琼脂平板上挑取单个可疑菌落移植至普通斜面进行纯培养。

1.2.3 生化试验 将上述分得的菌株分别进行糖醇类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验。

1.2.4 药敏试验 根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B琼脂法进行，观察大肠杆菌在体外对麦迪霉素、阿米卡星、米诺环素、左氧氟沙星、克林霉素、氨曲南、头孢西丁、头孢哌酮8种不同药物的敏感性。

1.2.5 动物接种试验 将分离到的菌株接种于普通肉汤，置37℃温箱培养24 h，吸取菌液分别采取皮下、腹腔注射于小白鼠0.3 mL/只，并设立对照组。

1.2.6 分子生物学试验 (1)16S rRNA基因组提取 将经纯培养得到的菌株接种于LB肉汤中，置37℃温箱培养24 h，吸取1 mL菌液置于1.5ML Eppendorf管中，使用Pormega公司基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，将提取的基因组DNA置于-20℃保存。(2)PCR预扩增 利用引物扩增已提取基因组DNA。引物序列：上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;下游引物：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。反应体系为25 μL：预混酶12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL；扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳，观察是否出现目的条带。(3)PCR扩增及胶回收 取基因组DNA进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳后，切下目的条带进行胶回收。扩增反应体系为50 μL：其中预混酶25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL；扩增条件同预扩增条件。胶回收按照Promega公司胶回收试剂盒步骤进行。(4)pGEM-T载体连接 胶回收产物与pGEM-T载体进行连接。连接体系为10 μL：其中T4DNA连接酶快速连接缓冲液5 μL，pGEM-T载体1 μL，胶回收产物2 μL，T4DNA连接酶1 μL，去离子水1 μL，4℃孵育过夜。(5)连接产物转化感受态大肠杆菌 按照下列Promega公司pGEM-T载体连接反应产物转化步骤进行。①离心时连接反应内容物汇集到管底，取2 μL连接产物加到置于冰上的1.5 μL离心管中。② 将冻存的JM109高效率感受态细胞从-70℃冰箱取出，放置在冰浴直至融化(大概5 分钟)，轻轻振动离心管使之混匀。③ 向已加入连接反应产物的转化管中加入50 μL感受态细胞。④ 轻轻振动小管混匀，冰浴20 min。⑤ 在精确的42℃水浴中热击45～50 s(不要振动)。⑥ 迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2 min。⑦ 每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的950 μL SOC培养基。⑧ 在37℃振荡培养(150 rpm)1.5 h。⑨ 将转化培养基100 μL涂到LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上。⑩将平板于37℃过夜培养(16～24 h)。(6)阳性重组质粒的鉴定 挑取平板中的白斑(阳性)于LB肉汤中置于37℃摇床中过夜培养；吸取菌液进行PCR扩增，反应体系及反应条件均同PCR预扩增条件；PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳，观察是否出现目的条带。(7)测序 若电泳检测出现目的条带，说明连接转化成功，即吸取1mL菌液置于1.5 mL Eppendorf管于中送生物公司测序。(8)序列分析 将生物公司测序后的序列经BLAST比对后得到序列比对结果。

2 结果与分析

2.1 试验结果

2.1.1 细菌培养特性 普通肉汤呈浑浊生长，少量絮状沉淀，振易散，普通琼脂平板上菌落呈透明圆形，光滑湿润，边缘整齐，轻度隆起，菌落大小约2～3 mm；麦康凯琼脂平板上呈光滑湿润，边缘整齐的红色小菌落；伊红美兰琼脂平板上呈黑色带金属光泽的菌落；血琼脂平板上菌落呈圆形湿润，且不溶血。

2.1.2 生化试验结果 经细菌染色、培养特性、生化试验等初步确诊为大肠杆菌(见表1)。

表1 生化试验结果

注：+：阳性；-：阴性；

2.1.3 药敏试验结果

表2 药敏试验结果

2.1.4 动物接种试验结果

表3 动物接种试验结果

取死亡小鼠肝、脾组织接种于普通琼脂平板均分离到原感染细菌，涂片镜检为革兰氏阴性短杆菌(见图1)。

图1 革兰氏染色， 1000×

2.1.4 PCR扩增产物电泳结果 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳后，得到约1500bp的目的条带(见图2)。

2.1.5 连接产物转化后电泳结果 连接产物经转化后挑取白斑接种于LB肉汤中，置于37℃摇床过夜培养。吸取菌液经1%琼脂糖凝胶(含溴乙锭)电泳后，观察有明显的约1500bp的目的条带。说明载体连接成功(图3)。

1：PCR扩增结果；M：DL-2000 DNA Marker

1：1号白斑扩增结果；2:2号白斑扩增结果；M：DL-5000 DNA Marker

2.1.6 测序结果

序列比对结果表明此序列同大肠杆菌序列同源性为99%。

3 讨论

随着养殖业的发展，细菌性疾病对养殖业的影响越来越严重，及时检测出致病原因并采取相应措施对养殖户来说至关重要。本事验旨在对病死梅花鹿内脏组织进行细菌学试验及分子生物学试验，快速有效的检测出其致死原因以便提出相应的预防及治疗方案。

本试验较全面的从细菌形态及培养特性观察、生化试验、药敏试验、致病性检测以及分子生物学试验五个方面对病死梅花鹿内脏组织进行检测，且根据大肠杆菌致病特点及养殖户对病死梅花鹿临床特征的描述，最终确定引起梅花鹿死亡的原因为大肠杆菌。

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Isolation and Identification of \%Escherichia coli \%from Dead Sika

SONG De-hua

(LintaoAgriculturalSchool,DingxiGansu730500China)

Pathological samples of dead sika was collected from a farm of Tianzhu, pathogenic bacterium was identified primitively by culturing isolated bacterial, observing morphology, identifying biological trait, medical sensitivity experiment and animal pathogenicity test. We extracted genomic DNA of the isolated strain, used primers for PCR amplification and got the expected gene fragment. Cutting the target band and proceeding gel extraction, production and pGEM-T was ligated and transformed. Finally, positive blot was picked and cultured in LB-Broth-Medium. Combined the result of bacteriological experiment and the result of biology company sequenced, \%Escherichia coli \%was identified finally, and there are some omnibus control measures was adopted on the basis of result.

Sika; \%Escherichia coli;\% isolation; identification

2016-04-12

宋得华 (1978-)，男，甘肃临洮人，本科，从事兽医临床工作与研究。电子邮件：westdotianqihui@163.com。

S 855.1+2

A

1004-6704(2016)06-0051-04