囊胚冷冻保存时间对复苏移植临床结局的影响

王雪，甄璟然，孙正怡，郁琦，邓成艳，周远征，王含必，何方方

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科生殖中心，北京　100730)

·临床研究·

囊胚冷冻保存时间对复苏移植临床结局的影响

王雪，甄璟然，孙正怡*，郁琦，邓成艳，周远征，王含必，何方方

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科生殖中心，北京100730)

【摘要】目的分析冷冻保存时间对复苏后胚胎质量的影响，进一步探讨长期胚胎冷冻保存是否对临床结局产生影响。方法回顾性分析2005年12月至2015年1月在我院辅助生殖中心进行复苏囊胚移植患者的临床资料。按照复苏前囊胚的冷冻保存时间将1 808个移植周期分为7组，第1组为≤90 d、第2组为91～180 d、第3组为181～360 d、第4组为361～720 d、第5组为721～1 080 d、第6组为1 081～1 440 d、第7组为≥1 441 d。比较7组的复苏后存活率、种植率、临床妊娠率、流产率和活产率以及各组间单胎的新生儿出生结局。结果7组间胚胎存活率、胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、流产率和活产率比较均无统计学差异(P均>0.05)；7组间的单胎新生儿出生结局比较亦无统计学差异(P>0.05)。结论本研究提示胚胎长期冷冻保存对冻融胚胎的质量及发育潜力影响不大，但囊胚长期冷冻保存的远期安全性还有待于进一步研究。

【关键词】冻融胚胎移植；冷冻保存时间；种植率；临床妊娠率；活产率

Objective： To analyze the effect of cryopreservation storage time on embryo quality after frozen-thawed and clinical pregnancy outcome.

Methods： The data of 1 808 transfer cycles with frozen-thawed blastocysts in our productive center from December 2005 to January 2015 were retrospectively analyzed. The patients were divided into 7 groups according to the cryopreservation storage time：group 1(≤90 days)；group 2 (91-180 days)；group 3 (181-360 days)；group 4 (361-720 days)；group 5 (721-1 080 days)；group 6 (1 081-1 440 days)；group 7(≥1 441 days). And then the survival rate，implantation rate，pregnancy rate and live birth rate were compared among the seven groups.

Results： The storage time did not significantly affect embryo survival rate. There were no significant differences in implantation rate，pregnancy rate，abortion rate and live birth rate among the seven groups (all P>0.05). The outcomes of single fetus newborn were also not significantly different(P>0.05).

Conclusions： The study results indicate that the cryopreservation storage time do not affect embryo quality and embryo developmental potential. More studies are needed to evaluate the safety of long-term cryopreservation.

Key words： Frozen-thawed embryo transfer；Cryopreservation storage time；Implantation rate；Pregnancy rate；Live birth rate

(J Reprod Med 2016，25(5)：389-394)

自1983年第一例人类冷冻胚胎成功临床妊娠后，人类胚胎冷冻保存技术迅速发展并广泛地被世界各地的辅助生殖中心接受，成为辅助生殖技术的重要组成部分。胚胎冻融移植能够降低卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生率，并可通过控制移植胚胎数而减少多胎发生，由此可提高治疗的安全性；同时还能提供多次胚胎移植机会，从而提高一次取卵周期的累积妊娠率，降低患者治疗费用。近年来随着卵巢超排卵方案和实验室技术的改善，以及对生育力保护的强调，冷冻胚胎的数量不断增加。大量胚胎被冷冻保存数年，就引起了人们对于储存时间对胚胎活力和随后种植能力的影响的关注。有研究发现胚胎冷冻保存时间不会影响胚胎质量[1-3]，但是也有研究发现人类胚胎冷冻保存几个月后，胚胎的细胞死亡增加[4-5]。目前关于囊胚玻璃化冷冻的保存时间与临床结局相关的数据较少，因此本研究将分析不同冷冻保存时间对复苏后胚胎质量的影响，进一步探讨长期胚胎冷冻保存是否对临床结局产生影响。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2005年12月至2015年1月在北京协和医院辅助生殖中心进行复苏囊胚移植患者的临床资料。所有囊胚均采用玻璃化方法进行冷冻和复苏。

纳入标准：新鲜周期的不育原因为输卵管因素、子宫内膜异位症及子宫腺肌症、男方因素、排卵障碍(包括多囊卵巢综合征等)、不明原因不育。

共收集1 811个复苏周期，其中3例因为移植日胚胎质量差放弃移植，因此可纳入分析的周期数为1 808个。按照复苏前囊胚的冷冻保存时间分为7组，第1组为≤90 d、第2组为91～180 d、第3组为181～360 d、第4组为361～720 d、第5组为721～1 080 d、第6组为1 081～1 440 d、第7组为≥1 441 d。

二、研究方法

1. 囊胚培养及质量评价：取卵周期采用本中心常规方案进行超促排卵，获卵后根据患者情况采用体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)授精，取卵24 h后观察受精情况，72 h观察卵裂球胚胎情况，根据胚胎评分情况决定移植；移植后剩余胚胎经患者知情同意后全部行囊胚培养，在受精后第5日或第6日分别观察囊胚形成情况及形态，采用Gardner评分系统对囊胚进行评分。首先根据囊腔扩张程度分为1～6期，然后对4～6期的囊胚进一步根据内细胞团(ICM)和滋养外胚层细胞(TE)表现评为A～C级。

2. 囊胚冷冻：鉴于先前发现早期囊胚及孵出的囊胚冷冻后复苏率不甚理想[6]，故而本中心均在囊胚发育至4期时选取内细胞团质量A或B级的囊胚冻存，C级者放弃，而滋养层细胞质量不限。

本中心全部采用玻璃化冷冻方法进行胚胎冷冻。具体方法如以往文章所述[7-8]。囊胚冷冻之前进行人工皱缩，然后将囊胚放入含有7.5%(v/v)DMSO和7.5%(v/v)乙二醇的预平衡液中平衡2 min，之后将胚胎转移入玻璃化冷冻液[15%(v/v)DMSO+15%(v/v)乙二醇+0.65 mol/L蔗糖+10 mg/ml Ficoll]中平衡30 s，将胚胎转移至冷冻环(cryoloop环)上，直接浸入液氮保存。

3. 胚胎复苏：于移植当天进行。囊胚复苏之前，在胚胎培养皿内分别配制复苏液：0.33 mol/L蔗糖溶液、0.2 mol/L蔗糖溶液和基础培养液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)；将载有囊胚的冷冻环从液氮中取出，空气中停留5 s后直接将胚胎依次浸入上述复苏液中，时间分别为2 min、3 min和5 min；复苏后囊胚在远离细胞团的透明带上部位激光切割透明带1/4左右行辅助孵化；将囊胚移入预先配制的囊胚培养液(G2，Vitrolife，瑞典)中，于37℃、6% CO2和5% O2的培养箱内培养2 h。囊胚腔重新扩张者判断为囊胚存活。

4. 子宫内膜准备及胚胎移植：内膜准备方法分为两种：(1)自然周期法：用于月经周期规律、排卵正常的患者，在排卵前注射HCG 2 000 U(艾泽，默克-雪兰诺，德国)，于超声监测到卵泡破裂后开始黄体支持，肌注黄体酮(浙江仙琚)20～40 mg/d，在排卵后第6日移植胚胎。(2)人工周期法：月经第2～4日常规B超检查，口服戊酸雌二醇(补佳乐，先灵，德国)，根据患者既往内膜情况，选择不同起始剂量(2～18 mg/d)。当内膜厚度≥8 mm时肌注黄体酮(20 mg×2 d、40 mg×2 d、20～40 mg×1 d)，肌注黄体酮后第6日在B超引导下行囊胚复苏移植，每周期移植1～2枚胚胎。移植后常规肌注黄体酮行黄体支持。

5. 妊娠结局判断：移植后第7日测血清HCG>5 U/L判定为生化妊娠，移植后4周超声检查见胎心和胎囊则为临床妊娠。种植率：B超下妊娠囊总数占移植囊胚总数的百分比；早期妊娠丢失率：移植后第7日判定为生化妊娠而之后超声未见胎囊者的例数与复苏移植周期总例数的百分比；临床妊娠率：临床妊娠总例数与复苏移植周期总例数的百分比；流产率：妊娠过程中流产的例数占临床妊娠总例数的百分比；活产率：随访获得活产的总例数与复苏移植周期总例数的百分比。

三、统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，所测数据采用均数±标准差表示，均数比较采用t检验，率的比较进行卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、总体情况

本研究共收集1 811个复苏周期，其中3例因为移植日胚胎质量差放弃移植，因此可纳入分析的周期数为1 808个。复苏胚胎3 368个，存活3 238个，存活率为96.1%。平均移植胚胎数为(1.79±0.42)个。超声下见到妊娠囊1 483个，种植率为45.7%(1 483/3 242)；1 096例患者获得临床妊娠，临床妊娠率为60.6%(1 096/1 808)；妊娠后流产115例，流产率为10.7%(117/1 096)；宫外孕发生率为1.3%(14/1 096)；活产率为53.4%(965/1 808)。

二、不同冷冻保存时间的胚胎复苏情况

囊胚冷冻时的各组患者平均年龄和内膜厚度比较均无统计学差异(P>0.05)，复苏移植时的患者年龄和不育年限比较有统计学差异，随着胚胎冷冻保存时间的增加，复苏时年龄增加(P<0.05)。尽管各组间移植胚胎数比较无统计学差异(P>0.05)，但是第7组的移植胚胎数略低(表1)。

三、不同冷冻保存时间的胚胎复苏后临床结局

7组的胚胎存活率、胚胎种植率、早期妊娠丢失率、临床妊娠率、流产率和活产率之间均无统计学差异(P均>0.05)，但第5组的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率略低于其他组(表2)。

四、不同冷冻保存时间的胚胎复苏后的出生结局

多胎妊娠的影响因素较多，为了避免降低分析的有效性，在本研究中我们只分析复苏单囊胚移植的出生结局。我们发现7组间的孕天数、婴儿出生体重及体长比较均无统计学差异(P均>0.05)，低出生体重比例、男女性别比和畸形率亦无统计学差异(P均>0.05)(表3)。

表1　各组患者一般情况比较 (x-±s)

注：组间比较，*P<0.05

表2　不同冷冻保存时间的胚胎复苏后的临床结局(%)

表3　单胎新生儿出生结局 (x-±s)

讨论

胚胎冷冻技术是指将胚胎置于超低温的环境(液氮，-196℃)中冷冻保存，待需要时再将冷冻的胚胎解冻恢复至正常生理温度的技术。胚胎冷冻技术的出现，不仅可以使一次促排卵周期中形成的过剩胚胎得到保存，也避免了移植胚胎数量过多而引起的多胎，提高了治疗的安全性，使患者从一次促排卵治疗周期中获得多次胚胎移植机会，大大提高了临床累计妊娠率。因此，胚胎冷冻保存技术在辅助生殖操作中得到广泛应用。但是人们不禁担心液氮中胚胎长期存放的安全性，以及随着冻存时间的延长，解冻后胚胎的复苏率和妊娠率等临床结局会否受到影响。目前这些尚无定论。而且在之前的研究中，多是以慢速冷冻卵裂期胚胎为主，关于囊胚期胚胎玻璃化冷冻的研究较少。因此本研究着重分析囊胚玻璃化冷冻的保存时间对胚胎存活和临床结局的影响。

关于胚胎在液氮中的保存时间尚无明确结论。早期有研究发现随着冷冻保存时间的延长，人胚胎的复苏后存活率下降[4]，小鼠胚胎复苏后的活力下降且染色体异常的发生率增加[9]。但后期大多数学者认为胚胎的冷冻保存时间不会影响冻融胚胎的质量和存活。因为在超低温中细胞的酶活力几乎完全受抑，细胞进程处于“停滞”状态，Mazur[10]认为细胞在液氮中保存千年依然可以存活并保持其发育潜能。Cohen等[11]发现胚胎的冷冻保存时间对卵裂球存活率没有显著影响，Lavara等[12]发现冷冻保存时间对兔胚胎的存活率没有影响，最近Riggs等[13]对人胚胎进行的一个大样本的研究也表明冷冻时间的长短并不影响胚胎复苏后的存活率。但是这些研究多是分析卵裂期胚胎冷冻的结局。最近Wirleitner等[14]分析了囊胚玻璃化冷冻后不同冻存时间的复苏后存活情况，也发现囊胚的冷冻保存时间对囊胚复苏后的存活率没有显著影响。我们的研究结论与之相似，在本研究中我们全部采用玻璃化冷冻，发现冷冻保存时间对胚胎复苏后存活率没有显著影响。

为了进一步观察复苏后胚胎的发育潜能，我们分析了相关临床结局和冷冻时间的相关性。发现囊胚的冷冻保存时间对胚胎的种植率、临床妊娠率、流产率和活产率没有显著影响。同时我们还观察了新生儿出生结局，以分析囊胚长期冷冻保存的安全性。我们发现各组间新生儿的出生结局无统计学差异。因此，本研究认为囊胚长期冷冻保存是安全的，这与之前的研究结论相似。Riggs等[13]分析了原核期胚胎和卵裂期胚胎冷冻保存数年复苏后胚胎的活力与冷冻保存时间的关系，他们发现胚胎的冷冻保存时间不会影响复苏后胚胎的活力，也不会影响临床结局。Liu等[3]分析了卵裂期胚胎慢速冷冻复苏后，胚胎的保存时间与临床结局的关系，他们发现胚胎的冷冻保存时间不会影响卵裂期胚胎复苏后的存活率，也不会影响胚胎的种植率和临床妊娠率。目前胚胎的冷冻时机包括原核期、卵裂期和囊胚期，在前面的研究多是分析卵裂期胚胎长期冷冻保存后的结局，最近也有研究开始分析囊胚阶段冷冻保存时间与临床结局的关系。Yao等[15]分析了羊的桑葚胚或囊胚冷冻保存0.5年或7.5年后的临床结局，他们发现两组胚胎复苏后活力无显著性差异，追踪出生结局发现两组的出生率、性别比和出生体重均无明显差异，他们认为桑葚期或囊胚期胚胎可以在液氮中长期保存。Wirleitner等[14]发现人类囊胚玻璃化冷冻后的保存时间不会影响囊胚的活力和发育潜能，各组间的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率以及出生后的新生儿特征均无显著性差异。在本研究中，我们还发现第3～5组(冻存时间181～1 080 d)的临床妊娠率和活产率略低于保存时间短和保存时间更长组，分析原因可能与保存时间关系不大，可能是由于不同组别的患者特征造成的。如果患者在新鲜周期妊娠，意味着患者胚胎质量好，更容易形成囊胚，种植潜能高，而且距离下次复苏移植的时间会更久一些；而新鲜周期没有妊娠或发生早期流产的，意味着患者胚胎质量差，种植潜能差，多会在短期内再进行复苏移植。具体原因还有待于进一步研究。

虽然理论上胚胎在液氮中可以长期保存，但是我们知道液氮罐的安全使用和宇宙背景的辐射也可能会影响胚胎的长期保存。如果液氮罐保存不恰当，液氮补充不及时，都会影响胚胎的冷冻效果。为了保证胚胎冷冻时的降温速率更高，我们多采用开放性载体进行冷冻保存，而微生物也可以在低温下长期存活，因此在保存过程中存在污染风险[16]。关于宇宙辐射的影响，Glenister等[17]曾用相当于自然界2 000年的宇宙背景累积辐射作用于小鼠胚胎，但小鼠胚胎的生存能力并未受到可检测到的影响。

Dowling-Lacey等[18]曾报道原核期胚胎冷冻保存近20年后解冻移植，成功获得妊娠并分娩健康男婴。Reed等[19]也曾利用冻存13.5年的胚胎解冻移植，分娩一健康婴儿。本研究中冻融胚胎移植获得妊娠并分娩的病例中，最长冷冻保存时间为8.6年(3 085 d)。总之，本研究提示胚胎冷冻保存时间与冻融胚胎质量和其发育潜力无明显相关性，胚胎长期冷冻保存对新生儿结局无显著影响。但是目前关于胚胎冷冻复苏后妊娠获得的新生儿的随访数据较少，因此囊胚长期冷冻保存的远期安全性还有待于进一步研究。

【参考文献】

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[编辑：罗宏志]

Effect of long-term cryopreservation of human blastocysts on clinical pregnancy outcome

WANG Xue，ZHEN Jing-ran，SUN Zheng-yi*，YU Qi，DENG Cheng-yan，ZHOU Yuan-zheng，WANG Han-bi，HE Fang-fang

Department of Obstetrics & Gynecology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100730

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.001

【收稿日期】2016-01-04；【修回日期】2016-02-18

【作者简介】王雪，女，山东潍坊人，博士，实习研究员，生殖内分泌专业.(*通讯作者，Email：sunzhengyi@263.com)