肝脂肪酶基因-514C/T多态性与陕西地区非酒精性脂肪肝人群关系研究*

西安市第四医院(西安 710004)

杨利萍　江　梅△　李　汀　樊英华　常远鸿　阴　俊　王晓玲　郭　佳　王君化



肝脂肪酶基因-514C/T多态性与陕西地区非酒精性脂肪肝人群关系研究*

西安市第四医院(西安 710004)

杨利萍江梅△李汀樊英华常远鸿阴俊王晓玲郭佳王君化

摘要目的：比较陕西地区人群中非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者与正常人群肝脂肪酶(HLG)-514C/T多态性分布差异，探讨其与NAFLD发病易感性关系。方法：选取NAFLD患者96例及正常对照组98例，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因多态位点检测HLG-514位点基因型,并测量其体重指数、腰臀比、血压、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、空腹血糖指数。结果：正常对照组HLG-514 CC、CT、TT基因型分别是26.5%、59.2%、14.2%，NAFLD组31.3%、63.5%、5.2%，两组CC基因型频率和C等位基因频率比较有统计学差异。结论：肝脂肪酶-514C/T以杂合子C/T基因型所占的百分比高，其基因多态性与陕西NAFLD患者发病有关。

主题词非酒精性脂肪肝扩增片段长度多态性分析多态现象，单核苷酸脂肪酶/分析

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种与代谢综合征、胰岛素抵抗(Insulin resistance， IR)和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括单纯性脂肪肝(Simple fatty live，SFL)、脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis， NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌(Hepatocellular cellular,HCC)。NAFLD除直接或通过促进并存的其他肝病进展，导致肝功能衰竭、HCC和移植肝复发外，还参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。其发病主要与胰岛素抵抗和遗传易感有关[1]。肝脂肪酶是肝脏特有的调节肝内脂质代谢的关键酶，研究发现，肝脂肪酶基因(Hepatic lipase gene ,HLG)启动子区-514位点基因多态性与肝脂肪酶活性、血脂异常和IR相关[2]。本研究通过对比陕西地区NAFLD患者与健康人群中HLG-514位点基因型的分布情况，研究HLG-514位点不同基因型与NAFLD易感性的关系。

资料和方法

1一般资料选取2012年8月至2013年7月在陕西地区西安市第四医院、安康市第一人民医院、延安医学院第一附属医院住院、门诊及体检中心经临床和影像学诊断为NAFLD的患者96例作为研究组，其中男性46例，女性50例，平均年龄45岁。另选取同期同地健康体检者98例作为对照组，其中男性47例，女性51例，平均年龄44岁。两组对象进行问卷调查、体格检查、血清学检查和肝脏超声检查，进行脂肪肝流行病学调查。NAFLD诊断标准符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》标准[3]。剔除标准包括：患各型病毒性肝炎、肝硬化、近期服用肝损害药物及影响血脂代谢的药物、恶性肿瘤等疾病；乙醇摄入量>40g/周或近2周内有大量饮酒史；一级亲属中有2型糖尿病、高血压、高脂血症及其他代谢性疾病者。按性别、年龄、户籍地配对选取相同数量正常人作为对照组。研究对象年龄、性别等一般资料与对照组健康志愿者相比无统计学意义(P>0.05)。

2研究方法于清晨空腹状态行肝脏B超检查、测量身高、体重、血压、臀围、腰围。计算体重指数和腰臀比，采静脉血10ml，其中5ml用于检测空腹血糖、肝功、血脂及肝炎病毒血清学检查，另5ml采用改进的苯酚-氯仿提取方法提取基因组DNA，-20°C保存备用，取DNA样品2μl进行琼脂糖检测符合要求。

2.1引物设计及扩增：NCBI上确定位点序列，采用引物设计软件Primer Premier5进行引物设计(由北京三博远志生物技术有限责任公司合成)，并进行引物扩增，选择扩增条带单一、特异性好的引物进行试验；上游引物5‘-CAGAGGGGGAAGAAGTGTGT-3’，下游引物5‘-GGTGATGCTTGTGGTCAAAG-3’，扩增片段为139bp，梯度PCR扩增后确定最佳退火温度为61°C，94°C预变性5min，94°C变性50s，61°C退火40s，72°C延伸40s，72°C延伸10min，共34个循环。

2.2PCR产物检测：取5μlPCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测。

2.3非变性聚丙烯酰胺电泳进行基因多态位点检测：清洗玻板、胶条、烘干，将玻板固定，配制非变性聚丙烯酰胺凝胶，插入梳子，室温下聚合2h左右，4°C冰箱放置过夜，凝胶聚合后，拔出梳齿，取PCR产物置于PCR管中，离心混匀，变形后冰浴，上样，然后电泳，银染聚丙烯酰胺凝胶，观察结果并拍照保存。

2.4测序验证试验结果：根据非变性聚丙烯酰胺电泳及检测结果选取HLG基因样本，寄送至北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序验证，确定HLG-514基因型。

3统计学方法等位基因频率=(纯合子例数X2+杂合子例数)/(2X总例数);统计学分析采用Hardy-Weinberg定律、连锁不平衡分析、等位基因频率和基因型分布用计数资料表示。

结果

对194份DNA(98名健康对照、96例NAFLD患者)进行基因型分析，发现在NAFLD与正常组中， TT基因型的分布频率分别为5.2%和14.2%，CT基因型分布频率分别为63.5%和59.2%， CC基因型分布频率分别为31.3%和26.5%，两组比较有统计学差异(P<0.05)。经Hardy-Weinberg平衡检验，两组间等位基因频率也有统计学差异(P<0.05)，见附表。

附表　HLG-514基因多态性基因型

讨论

国外研究认为NAFLD的发病与个体及多种社会因素密切相关，不同种族、地域、体质的人群发病的危险因素各有特点，预防措施存在差异。近年来，随着饮食结构和生活习惯的改变，我国特别是城市地区的NAFLD的发病率明显上升。尽管目前我国有一些NAFLD的流行病学调查，但绝大部分是基于特殊的职业人群或医院，而针对普通人群的调查较少，仅见上海市有以普通城市人群相关NAFLD流行病学调查报告，但仍缺乏对于陕西省城市地区普通人群NAFLD流行病学研究。

近年来，有研究认为某些调节肝脏脂肪代谢的基因与NAFLD的发病及发展有着密切关系，相关基因的多态性与NAFLD的关系也有研究报道，但目前国内都仅限于小样本的研究，尚缺乏大样本、多中心的研究。

Saibara等用PCR检测95例NASH患者等位基因A2217G的多态性，发现G/G纯合子组易出现肝细胞气球样变且年龄轻，提示遗传因素参与NASH发病。国内周永健[4-5]等研究发现脂肪细胞因子如脂联素、过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ(PPAR-γ)、 肝脂肪酶基因(Hepatic lipase gene，HLG)启动子区-514位点基因多态性与肝脂肪酶活性、血脂异常和IR相关、以及磷脂中磷脂酰胆碱磷脂酰乙醇胺N - 甲基转移酶( PEMT)与NAFLD的发生与发展相关。

肝脂肪酶是由肝脏特异性合成并表达的调节肝脏脂质蛋白代谢的关键酶。肝脂肪酶选择性分解脂蛋白中的甘油三酯和磷脂，还可与脂蛋白结合，参与脂蛋白的跨膜转运[6]。其活性与内脏脂肪含量呈正相关。研究发现肝脂肪酶活性受多因素调控，其中HLG启动子区-514位点基因多态性与肝脂肪酶活性的关系密切，对细胞株的瞬时转染实验发现，HLG-514T变异可使HLG转录活性下降约30%，使肝脂肪酶活性降低[7]。我们的研究发现，野生纯合子(CC型)NAFLD发病的易感性明显高于T等位基因携带者，HLG-514变异可令NAFLD发病易感性降低。对比不同种族间各基因型频率和等位基因频率的差异，发现华人与韩国人及美国黑种人T等位基因频率接近，均高于美国白种人，这种基因分布的差异与美国黑人非酒精性脂肪肝发病率较白人低的情况一致[8-10]。

我们通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对98名正常人，96例NAFLD患者的HLG-514启动子区位点的多态性进行了检测，发现该多态性位点的CT基因型在NAFLD人群中(63.5%)高于正常对照组(59.2%)，CC基因型在NAFLD患者中(31.3%)高于健康对照者(26.5%)，有统计学差异，提示HLG启动子区-514基因与陕西省NAFLD患者有关。但我们在NAFLD患者中进行基因多态性的研究，仅对陕西省汉族人进行了分析，样本例数相对较少，对HLG-基因多态性与NAFLD发病的关系尚需大样本、多地域、多民族广泛深入协同研究。

参考文献

[1]Gaggini M，Morelli M，Buzzigoli E，etal．Non-Alcoholic fatty liver disease(NAFI.D)and its connection with insulln resistance，Dyslipidemia，Atherosclerosis and cororlary heart disease [J]．Nutrients，2013，5：1544-1560．

[2]Tai ES，Corella D，Deurenberg-Yap M，etal．Dietary fat interacts with the-514C>T polymorphism in the hepatic lipase gene promoter on plasma lipid profiles in a multiethnic Asian population：the 1998 Singapore National Health Survey[J]．Nutr，2003，133：3399-3408.

[3]中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010修订版)[J].胃肠病学和肝病学杂志，2010，19(6)：483-487.

[4]周永健，李瑜元. 过氧化物酶体增殖因子活化受体-基因多态性与非酒精性脂肪性肝病及脂联素的关系[J]. 中华消化杂志，2006，26(5)： 311-314.

[5]石胜利，周永健. 脂联素基因Gly15Gly多态性与非酒精性脂肪肝病的关系[J]. 广州医学院学报，2005，33(6)：1-3.

[6]Zambon A，Deeb SS，Bensadoun A，etal．In vivo evidence of a rolefor hepatic lipase in human apoB-containing lipoprotein metabolism，independent of its lipolytic activity[J]．J Lipid Res，2000，41：2094-2099．

[7]Deeb SS，Peng R. The C-514T polymorphism in the human hepatic lipase gene promoter diminishes its activity[J]．J Lipid Res，2000，41：155-158．

[8]Solga SF，Clark JM，Alkhuraishi AR，etal．Race and comorbid factors predict nonalcoholic fatty liver disease histopathology in severely obese patients[J]．Surg Obe s Relat Dis，2010，1：6-11.

[9]Shargorodsky M，Omelehenko E，Matas Z，etal．Relationbetween augmentation index and adiponectin du6ng one year metformin treatment for nonalcoholic steatohepatosis：Effects beyond glucose lowering[J]．Cardiovasc Diabetol，2012，11：61-68．

[10]Hong SH，Song J，Kim JQ．Genetic variations of the hepatic lipasegene in Korean patien with coronary artery disease[J]．Clin Biochem，2012，33：291-296．

(收稿：2015-03-04)

Association of hepatic lipase gene promoter polymorphism -514C/T with nonalcoholic fatty liver disease of Shanxi

The No.4 Hospital of Xi’an( Xi’an710004)

Yang LipingJiang MeiLi Tinget al

ABSTRACTObjective: To study the prevalence of the hepatic lipase gene (LIPC) promoter polymorphism(at position -514)in patients of Shanxi with nonalcoholic fatty live disease(NAFLD)，and its relationship with the susceptibility to NAFLD. Methods: Genotype of LIPC promoter was detected with non-denaturant polyacrylamide gel electrophoresis in 96 patients with NAFLD and 98 of normal control．Body mass index，waist-to-hip ratio(WHR)，blood pressure, CHOL, HDL, LDL,TG and FPG of the patients were measured. Results: The proportions of genotypes of CC、CT and TT at -514 of LIPC in healthy people were26.5%、59.2%、14.2%，respectively, whereas those in patients with NAFLD were 31.3%、63.5%、5.2%, The frequency of CC genotype and C allele in the NAFLD group were significantly higher than those in the control group. Conclusion:The proportions of genotypes of C/T are dominant at -514 of LIPC in patients with NAFLD and controls. Gene polymorphism of LIPC-5 14C/T is correlated with susceptibility to NAFLD of Shanxi.

KEY WORDSNon-alcoholic fatty liver diseaseAmplified fragment length polymorphism analysisPolymorphism, single nucleotideLipase/analysis

【中图分类号】R575.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.015

*陕西省自然科学基础研究计划重点项目(2011JM4036)

△通讯作者