兔Perthes病模型建立及股骨头p53、Bcl-2表达研究*

陕西省第四人民医院(西安710043)

张亚斌　姚永锋　庞仲辉



兔Perthes病模型建立及股骨头p53、Bcl-2表达研究*

陕西省第四人民医院(西安710043)

张亚斌姚永锋庞仲辉

摘要目的：建立Perthes病动物模型，观察股骨头相关凋亡基因的变化，探讨其在股骨头坏死中的作用。方法：将32只新西兰幼兔随机分为实验组和对照组，透视下经股骨颈给予实验组(A组)右侧股骨头(实验侧)内注射医用TH胶(含显影剂的d-氰基丙烯酸正辛酯)0.5ml，相同方法给予对照组(B组)注射生理盐水0.5ml，于建模后6、8、10、12 周分别取实验组和对照组两组右侧股骨头进行病理观察，观察两组股骨头p53 和Bcl-2凋亡基因表达变化。结果：建模后6周A组髋关节开始出现关节间隙增宽，出现点状出血，随着实验期的延长变性区并逐步扩大，股骨头骺板p53 基因表达与细胞凋亡率呈正相关性，Bcl-2 基因表达阳性率与细胞凋亡呈负相关性。B组股骨头未见明显异常。结论：经股骨颈注射医用TH胶建立Perthes 病动物模型稳定，无反复，且操作简单；证实p53和Bcl-2与Perthes 病发生相关性。

主题词股骨头坏死基因，p53基因,Bcl-2模型,动物细胞凋亡兔

Perthes病特指幼儿的股骨头坏死，早期如不能得到有效治疗，常并发髋关节畸形及功能障碍，且早期易引起关节炎，严重危及儿童的身心健康及参加社会劳动，目前病因还不明确，多数学者认为与各种原因引起的股骨头血液供应障碍有关[1]。目前国内外学者主要针对成人股骨头坏死的研究，且主要集中在外在病因的探寻，对于基因和分子水平研究较少。儿童的股骨头坏死发病较少，其研究也为之更少。因此，为从基因水平了解Perthes病的病因及发病机制，为该疾病的诊断和治疗提供理论依据，本实验通过建立给予股骨头内注射TH医用胶建立Perthes病的动物模型，在特定时间点观察实验组与对照组股骨头宏观和微观变化的变化，分析和研究p53和Bcl-2基因在在该疾病发病中的作用。

材料和方法

1实验动物与分组本次实验动物兔均来自西安交通大学医学院动物实验中心，32只，雌雄各半，拍片证实股骨头骺板未闭合骨化。实验动物随机分为实验组和对照组，实验在西安交通大学第二附属医院骨科动物实验室，时间为2011年12月至2012年05月，并严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》实施。

2建模将兔仰卧位固定于专用木制固定架上，给予硫喷妥钠静脉注射麻醉满意后，消毒应用骨穿刺套针经股骨颈穿刺，在透视下见穿刺针到达实验组右侧股骨头骺板远侧，向股骨头内注入医用TH0.5ml[2]。参照同上方法吸取0.5ml 生理盐水注射入对照组右侧股骨头内。所有实验动物单独放置于专用高笼内饲养，使其处于站立位，模拟人类站立位双侧髋关节负重的生理状态。

3实验取材将所有实验动物放置于相同环境下随机分笼饲养，于建模术后第6、8、10、12周分别取实验组和对照组动物各4只，按10 mg/kg人用氯胺酮臀大肌注射，在麻醉下给予动脉耳缘静脉内注射气体5ml致气体栓塞，动物死亡后保护下解剖实验侧股骨头，注意防止关节面损伤及人为骨折，并给予 10%甲醛溶液固定。

4实验观察

4.1大体变化:观察并记录实验动物精神状态、活动及体重变化,股骨头软骨面的颜色、形状和硬度。

4.2组织病理学观察：标本进行切片处理固定后，显微镜下将每张玻片随机分区标记，共10个区域，并在每个区域内计数及记录100个骨细胞及其内凋亡细胞数，每个区域内凋亡细胞总数进行合计，并对p53和Bcl-2进行指标测定。

4.3细胞凋亡检测：凋亡细胞检测按照TUNEL试剂盒说明书进行，可发现凋亡细胞内胞核为黄色颗粒(即阳性对照)。实验阳性对照与阴性对照染色对比，将10个区域内凋亡细胞总数进行标记和计算占总数百分比，凋亡率=(同一类型细胞的凋亡阳性细胞计数/细胞总数)×100%。

5统计学方法采用SPSS统计学软件，两组样本采用t检验组间比较，采用Pearson相关分析法分析股骨头骺板细胞凋亡率与p53和Bcl-2基因表达阳性率的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1实验动物数量分析本次实验动物有5只在此实验期间曾出现腹泻，给予口服土霉素后症状消失，32只动物在实验期间全部存活进入了结果分析。

2实验动物大体观察实验组动物右下肢于术后第6周出现轻微跛行，并逐渐加重至实验结束。对照组动物右下肢正常，无异常表现。实验观察两组动物体重及毛发光泽等方面无明显异常，呈正常生长。

3股骨头外观变化对照组右侧股骨头外观未见异常，与正常股骨头基本一致。实验组第6周时右侧髋关节周围组织开始肿胀，出现关节积液及关节间隙的增宽，随着试验时间延长部分股骨头软骨面可出现点状充血，并逐渐扩大；到达第12周时，实验组股骨头虽形态正常，未见塌陷，但股骨头软骨面失去鲜亮色泽，可见骨质疏松明显，骨质硬度差，易碎。

4实验组和对照组右侧股骨头病理变化实验组可见部分中断，且数量减少，骨细胞内可见脂肪变性且数量减少，部分骨细胞出现凋亡现象。骺板细胞排列发生变化且厚度变薄，可见有TH胶存留于骺板小静脉内将其栓塞(图1)。对照组右侧股骨头内骨小梁数量，组织结构未见明显变化，骨骺厚度及细胞形态和结构正常(图2)。

5凋亡细胞形态根据TUNEL试剂标记可见凋亡细胞染色其胞质呈淡黄色或棕黄色，阳性信号在核内分布，周围无炎性反应细胞，形态大小不一，核边界清楚(图2-c、d)。

6实验组和对照组细胞凋亡率变化见表1。

表1　各组动物细胞凋亡率比较±s, %)

注：与对照组同期比较，*P< 0.01

7凋亡基因指标变化实验组右侧股骨头p53和bcl-2基因的表达在第8、10、12周与对照组比较有统计学差异(P< 0.01)，见表2。

表2　两组凋亡诱导及抑制基因率比较±s, 100%)

注：与对照组同期比较，*P< 0.01

8相关性分析结果过Pearson相关分析表明Perthes病动物模型实验侧股骨头骺板细胞凋亡率与p53基因表达阳性率呈正相关性(P< 0.05)，与Bcl-2基因表达阳性率之间呈负相关性(P< 0.01)。

讨论

当前研究已经证实Perthes病患侧股骨头的骨内压明显高于健侧，而且患侧股骨头内一氧化氮合成酶含量也明显高于正常侧[3]，通过进一步研究发现，当发生Perthes病时，其股骨头内的p53基因升高，而Bcl-2基因出现降低，随着病程的发展，股骨头关节软骨及骺软骨细胞也开始出现了凋亡现象[4]，Perthes病发生。研究证明，Perthes病的发生从外因上与各种原因引起的儿童股骨头血流动力学障碍有着密不可分的关系，当某种因素造成股骨头局部血供障碍，组织细胞出现水肿，骨内压随之增高，当压力上升到足以阻挡动脉血液供入时，血液循环减少，组织进一步水肿，形成恶性循环，最终造成股骨头骨骺毛细血管内出现淤血，局部组织缺血缺氧 、引起无氧代谢增加，组织水肿渗出增加造成骨内压进一步升高，持续的缺血缺氧及血液回流缓慢，诱发血液的高凝状态[5]，持续的缺氧，出现了一氧化氮含量的减少，而氧自由基增加[6]。局部微环境的变化造成了骨细胞持续缺氧，如不能及时解除，在这种病理状态下凋亡基因p53被异常表达而凋亡抑制基因Bcl-2被抑制，表达减少，造成了局部骨细胞的坏死。在正常情况下p53能够诱导细胞的正常凋亡，当p53基因异常表达增加而Bcl-2凋亡抑制基因减少时会引起骨细胞出现的大量的凋亡及坏死[7]。通过给股骨头内注射医用TH胶建立Perthes病动物模型，造成局部静脉内栓塞，淤血，静脉回流不畅，造成局部压力升高，并且出现动脉血不能正常进入股骨头内，造成局部骨细胞出现缺血缺氧，不能维持正常代谢，导致了p53凋亡基因的异常表达和Bcl-2凋亡抑制基因表达的减少，引起了骨细胞的凋亡及坏死，因此可以证实当股骨头内血流动力学发生障碍时可以引起p53凋亡基因和Bcl-2凋亡抑制基因异常表达，该基因后期加速Perthes病的发生。实验发现：当各种原因造成股骨头血流动力学发生障碍时，局部的缺血缺氧状态诱导了p53和Bcl-2凋亡相关基因的异常表达，引起骨细胞出现程序性死亡，Perthes病发生，进一步加重了局部的缺血缺氧，进一步诱导p53和Bcl-2凋亡相关基因的异常表达造成骨细胞的进一步凋亡和坏死。本实验结果证实经股骨颈注射建立Perthes病模型引起股骨头局部缺血改变，局部骨内压升高，与各种原因引起的股骨头缺血，组织水肿基本一致，股骨头内局部血液循环障碍引起内压增高，反过来加重了组织缺血。持续的缺血，造成骨细胞正常代谢障碍，诱导了凋亡基因及凋亡抑制基因的异常表达，造成骨细胞持续性凋亡。如不能得到及时处理，随着组织缺血缺氧进一步加重，组织水肿，骨内压持续性升高，进一步造成血液循环障碍，诱导Bcl-2凋亡抑制基因表达进一步减少， p53凋亡诱导基因异常增加，股骨头关节软骨，骺软骨细胞持续性的凋亡及坏死，引起Perthes病发生。

因此，通过应用TH胶注射建立儿童股骨头坏死动物模型，造成股骨头微血栓形成，细胞缺血，组织水肿，骨内压增加，儿童股骨头坏死模型建立，异常的骨内微环境又诱导了p53 、Bcl-2等凋亡相关基因表达的变化，加速了骨细胞的凋亡，他们是Perthes病发生的并发因素并加速Perthes病的发生。本实验的研究对于Perthes病的发病机理进一步阐述，对该疾病的深入研究提供了理论支持。如何降低Perthes病股骨头内压力及抑制凋亡基因发生变化，降低股骨头坏死率仍需进一步研究。

参考文献

[1]王翠英,董晨辉,王爱民. 小儿股骨头坏死诊治研究进展[J]. 现代医药卫生,2014,(6):872-874.

[2]Johannesen J, Briody J, Mc Quade M,etal. Systemic effects of zoledronic acid in children with traumatic femoral head avascular necrosis and Legg-Calve-Perthes disease[J].Bone, 2009, 45: 898-902.

[3]张开放,李政,姚永锋,等. 股骨头骨骺缺血性坏死模型兔构建及组织病理学变化和p53与bcl-2的表达[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,(2):219-223.

[4] Uziel Y，Butbul- Aviel Y，Barash J，etal. Recurrent tran-sient synovitis of the hip in child Journal of clinical pPediatric surgery. Longterm outcome among 39 patients [J]. J Rheumatol，2006，33(4):810- 811.

[5]孟海涛,李林,王翠苹,等. Ⅱ型胶原基因型变化与Legg-perthes病发病的相关性研究[J]. 实用骨科杂志,2015,(2)：78-80.

[6] 俞松,谢祎. Perthes病的病因与治疗[J]. 实用医院临床杂志,2012,(4)：38-40.

[7] 胡野，凌志强，单小云，等. 细胞凋亡的分子医学[M]. 北京：军事医学科学出版社，2002：35- 45.

[8] Mapara MY，Bargou R，Zugck C，etal. APO-1 mediated apoptosis or proliferation inhuman chronic B lymphocytic leukemia：Correlation with Bcl- 2 oncogene expression[J]. Eur J Immunol，1993，23(3)：702- 708.

(收稿：2015-07-17)

Establishment of rabbit Perthes disease model and expression of p53 and Bcl-2 of the caput femoris

Fourth People’s Hospital of Shaanxi Province(Xi’an 710043)

Zhang Yabin Yao Yongfeng Pang Zhonghui

ABSTRACTObjective:To establish Perthes disease animal model to observe the changes of apoptosis gene that related to the caput femoris. Methods:32 New Zealand rabbit were randomly divided into experimental group and control group, and in the experimental group (group A), 0.5 ml medical TH glue was injected into the right side of the caput femoris under perspective through the collum femoris, 0.5 ml normal saline was injected to the control group with the same method. After the establishment of the model, the right side of the caput femoris in both groups were observed to see the apoptosis gene expression changes of p53 and BCL-2 of caput femoris in the 6th,8th,10th and 12th week. Results: After six weeks modeling, group A's hip joint gap widened, petechial hemorrhage could be seen. As the extension of the experimental phase degeneration area expanded gradually, the p53 gene expression of femoral epiphyseal plate had positive correlation with apoptosis rate, and the positive rate of BCL-2 gene expression was negative related to apoptosis. There was no obvious abnormality in the caput femoris of group B. Conclusion: It is stabile and has no reversal to establish the Perthes disease animal model via the injection of medical TH glue perthes through femoral neck, and the operation is simple. The correlation between p53 and BCL-2 and Perthes disease is confirmed.

KEY WORDSFemur head necrosisGenes,p53Genes,Bcl-2Models,animalApoprosisRabbits

【中图分类号】R392.3

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.003

*陕西省科学技术研究发展计划项目(S2012SF2889)