建立β3肾上腺素能受体过表达的心肌成纤维细胞模型方法的比较

张 源，王 丽，张 慧，马依彤，杨毅宁，马苗苗，朱晓丽

·论著·

建立β3肾上腺素能受体过表达的心肌成纤维细胞模型方法的比较

张 源，王 丽，张 慧，马依彤，杨毅宁，马苗苗，朱晓丽

【摘要】目的用两种不同的方法构建β3肾上腺素能受体(β3-AR)过表达的SD乳鼠心肌成纤维细胞(CFBs)模型，并对两种方法的效果进行比较，为今后在细胞水平观察β3-AR对心功能，尤其是对慢性心力衰竭(CHF)的影响提供新的实验方法。方法2015年3—6月，选取出生1～3 d的SFP级SD乳鼠8只。分离SD乳鼠CFBs并体外培养，随机分为3个感染复数(MOI)组，分别为MOI 50组、MOI 100组、MOI 200组，采用β3-AR基因过表达的慢病毒载体感染CFBs，利用流式细胞仪检测感染率，确定最佳MOI。将SD乳鼠CFBs随机分为4个β3-AR激动剂干预组，分别为正常对照组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组，采用不同浓度β3-AR激动剂干预CFBs，利用Western blotting法检测β3-AR表达水平，挑选出β3-AR激动剂干预CFBs的最适浓度。结果普通光学显微镜下观察CFBs，无搏动性，大多数呈梭形，其细胞核较大，胞质透明。倒置荧光显微镜下观察感染24、48、72、96 h时CFBs状态及荧光表达情况，感染72 h时，各MOI组CFBs生长状态较好，细胞大多数呈梭形，无搏动性，细胞核较大，且肉眼观察荧光表达最佳。MOI 100组、MOI 200组感染率高于MOI 50组(P<0.05)；MOI 200组感染率低于MOI 100组(P<0.05)。10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组β3-AR表达水平高于正常对照组(P<0.05)；10-5mol/L组β3-AR表达水平高于10-6mol/L组、10-4mol/L组(P<0.05)。10-5mol/L组、MOI 100组β3-AR表达水平高于正常对照组(P<0.05)；MOI 100组β3-AR表达水平高于10-5mol/L组(P<0.05)。结论使用β3-AR过表达的慢病毒载体感染CFBs与β3-AR激动剂干预CFBs均可使其β3-AR过表达，且前者效果优于后者。

【关键词】受体,肾上腺素能β3；成纤维细胞；心肌；慢病毒载体

张源，王丽，张慧，等.建立β3肾上腺素能受体过表达的心肌成纤维细胞模型方法的比较[J].中国全科医学，2016，19(15)：1774-1780.[www.chinagp.net]

Zhang Y,Wang L,Zhang H,et al.Comparison of two methods of building cardiac fibroblasts models with β3-AR overexpression[J].Chinese General Practice，2016，19(15)：1774-1780.

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心血管疾病的最终转归，表现为复杂的心肌结构、表型和功能的变化，神经体液的代偿与失代偿贯穿始终。而交感神经系统是CHF过程中神经体液调节的核心。近年来关于β3肾上腺素能受体(β3adrenergic receptor，β3-AR)的研究逐渐成为热点[1]。以往研究认为，β3-AR主要分布于人体脂肪、肠道和肺组织，参与脂肪分解和能量代谢，与心脏关系不大[2]。β3-AR于1989年被成功克隆和鉴定后，学者发现其也广泛分布于心脏及血管组织中[3]。有许多研究表明，CHF时β3-AR表达水平升高，促进心肌重构，恶化患者的心功能，但其具体机制尚未明确[4]。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFBs)的增殖和纤维化是心肌重构的重要过程，且具有易培养、易生长等优势，因此其有潜在的基因治疗靶细胞的特性。由于β3-AR在正常心肌组织中分布很少，不便于观察与检测，因此本研究通过两种方法诱导CFBs中的β3-AR过表达，并对比其效果，便于今后在细胞水平观察β3-AR对心功能的影响。

1材料与方法

1.1主要材料2015年3—6月，选取出生1～3 d的SPF级SD乳鼠8只，雌雄不限，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心提供〔动物合格证号：SCXK(新)2011-0004〕。β3-AR过表达的慢病毒载体(含有绿色荧光蛋白)由赛业(广州)生物科技有限公司提供(慢病毒目的基因序列号：NM_013108.2)；β3-AR抗体(型号：M-20，Santa Cruz公司，日本)；β3-AR激动剂(型号：BRL37344，Sigma公司，美国)；胎牛血清、高糖达氏改良伊格尔(DMEM)培养基(Gibco公司，美国)；双抗、谷氨酰胺、D-Hanks、胰酶、牛血清清蛋白(BSA)(HyClone公司，美国)；Ⅱ型胶原酶(Worthington公司，美国)；膜蛋白提取试剂盒(Merck公司，德国)。

1.2研究方法

1.2.1CFBs的分离、培养及形态观察取8只SD乳鼠，分别用溶于D-Hanks中的胰酶、Ⅱ型胶原酶依次消化分离心肌组织，通过2次差速贴壁法分离、收集并培养乳鼠CFBs，应用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育48 h，在普通光学显微镜下观察CFBs形态。以后每隔2～3 d进行1次细胞传代，传至第2代的CFBs可用于实验。

1.2.2CFBs感染实验将CFBs传至第2代，按1×106个/孔接种于6孔板内，每孔加入高糖DMEM培养液1 ml培养48 h。随机分为3个感染复数(multiply of infection，MOI)组，分别为MOI 50组、MOI 100组、MOI 200组，按照不同的MOI将β3-AR过表达的慢病毒载体加入培养基中继续培养，每组设立2个平行复孔。分别于感染后24、48、72、96 h在倒置荧光显微镜下观察细胞状态及荧光表达情况。

1.2.3流式细胞仪检测感染率观察细胞状态及荧光表达情况后选取不同MOI组最佳时间点CFBs，采用流式细胞仪检测感染率，确定最佳MOI。将细胞用胰酶消化后，收集细胞悬液，1 000 r/min离心3 min(离心半径8 cm)，4 ℃磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，用4%多聚甲醛溶液室温固定40 min，1 000 r/min离心5 min(离心半径8 cm)，去上清液，最后用PBS重悬细胞，将细胞混匀成为单细胞悬液，每个样品取200 μl单细胞悬液，将各组样品放入流式细胞仪内检测，采用CELL Quest软件分析感染率，确定最佳MOI(感染率最高的MOI)。实验独立重复3次。

1.2.4不同浓度β3-AR激动剂干预CFBs传至第2代的CFBs培养48 h，将培养液换成不含胎牛血清的低糖DMEM培养基，使细胞保持在饥饿状态，孵育24 h后，随机分为4个β3-AR激动剂干预组，分别为正常对照组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组。10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组分别加入相应浓度β3-AR激动剂，正常对照组不进行干预处理。继续培养48 h后用于实验检测。

1.2.5Western blotting法检测β3-AR表达水平按照膜蛋白提取试剂盒说明书提取感染率最高的MOI组及不同浓度β3-AR激动剂干预组CFBs膜蛋白，检测蛋白浓度，每孔40 μg上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，BSA室温封膜，加入β3-AR抗体、GAPDH抗体，4 ℃过夜。次日用0.05% TBST 洗膜，加入二抗孵育2 h，洗膜后采用3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)法显色，Bio-Rad成像分析系统扫描，Image Lab软件分析灰度值，采用目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值(IOD)表示目的蛋白相对表达水平，即β3-AR表达水平。实验独立重复3次。挑选出β3-AR激动剂干预CFBs的最适浓度，并与正常对照组、感染率最高的MOI组β3-AR表达水平进行比较。

2结果

2.1CFBs形态普通光学显微镜下观察CFBs，无搏动性，大多数呈梭形，其细胞核较大，胞质透明(见图1)。

图1　普通光学显微镜下第2代心肌成纤维细胞(×200)

Figure1Thesecondgenerationofcardiacfibroblastsobservedunderordinaryopticsmicroscope

2.2CFBs状态及荧光表达情况倒置荧光显微镜下观察感染24、48、72、96 h时CFBs状态及荧光表达情况：感染24 h时，各MOI组细胞较稀疏，部分形态还未完全变为梭形，荧光表达不显著；感染48 h时，各MOI组荧光表达较感染24 h时有所增加，细胞大部分呈梭形；感染72 h时，各MOI组CFBs生长状态较好，细胞大多数呈梭形，无搏动性，细胞核较大，且肉眼观察荧光表达最佳；感染96 h时，各MOI组细胞密度降低，荧光表达不如感染72 h时，但较感染24 h和感染48 h时荧光表达增多(见图2～5)。

2.3感染率比较MOI 50组、MOI 100组、MOI 200组均是感染72 h时感染率最高，分别为(34.80±0.03)%、(72.80±0.02)%、(44.10±0.03)%(见图6)。3组感染率比较，差异有统计学意义(F=1 605 122.73，P<0.001)；其中MOI 100组、MOI 200组感染率高于MOI 50组，差异有统计学意义(P<0.05)；MOI 200组感染率低于MOI 100组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4β3-AR表达水平比较

2.4.1不同浓度β3-AR激动剂干预组β3-AR表达水平比较4组β3-AR表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组β3-AR表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；10-5mol/L组β3-AR表达水平高于10-6mol/L组、10-4mol/L组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1、图7)。

2.4.2正常对照组、10-5mol/L组、MOI 100组β3-AR表达水平比较3组β3-AR表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。10-5mol/L组、MOI 100组β3-AR表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；MOI 100组β3-AR表达水平高于10-5mol/L组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图8)。

Table1Comparisonoftheexpressionlevelofβ3-ARamongintenventiongroupsofdifferentconcentrationsofβ3-ARagonists

组别β3-AR正常对照组0.07±0.0110-6mol/L组0.20±0.01a10-5mol/L组0.25±0.02ab10-4mol/L组0.21±0.01acF值105.02P值<0.001

注：β3-AR=β3肾上腺素能受体；与正常对照组比较，aP<0.05；与10-6mol/L组比较，bP<0.05；与10-5mol/L组比较，cP<0.05

注：MOI=感染复数；A为荧光场，B为明光场

图2各MOI组感染24 h时CFBs荧光表达情况(×200)

Figure 2Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 24 h after infection

注：A为荧光场，B为明光场

图3各MOI组感染48 h时CFBs荧光表达情况(×200)

Figure 3Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 48 h after infection

注：A为荧光场，B为明光场

图4各MOI组感染72 h时CFBs荧光表达情况(×200)

Figure 4Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 72 h after infection

注：A为荧光场，B为明光场

图5各MOI 组感染96 h时CFBs荧光表达情况(×200)

Figure 5Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 96 h after infection

图6　流式细胞仪检测不同MOI组72 h时的感染率

注：从左至右分别为正常对照组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组

图7不同浓度β3-AR激动剂干预组SDS-PAGE图

Figure 7Sodium dodecyl sulfate polypropylene acyl ammonia gel electrophoresis figure of intervention groups of differnet concentrations of β3-AR agonists

Table 2Comparison of the expression level of β3-AR among normal control group,10-5mol/L group and MOI 100 group

组别β3-AR正常对照组0.05±0.0110-5mol/L组0.18±0.03aMOI100组0.81±0.03abF值736.71P值<0.001

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与10-5mol/L组比较，bP<0.05

注：从左至右分别为10-5mol/L组、MOI 100组、正常对照组

图8正常对照组、10-5mol/L组、MOI 100组SDS-PAGE图

Figure 8Sodium dodecyl sulfate polypropylene acyl ammonia gel electrophoresis figure of normal control group,10-5mol/L group and MOI 100 group

3讨论

CHF过程中交感神经系统持续激活，儿茶酚胺通过激活β1肾上腺素能受体(β1-AR)、β2肾上腺素能受体(β2-AR)、β3-AR介导其产生血管、心脏生物效应[5]。目前大多数研究认为，衰竭心肌组织中β3-AR表达水平升高，介导负性变力作用，恶化心功能[6-7]。还有研究认为，β3-AR激活后可促进心肌纤维化，介导心肌重构，参与CHF进展[8]。然而也有研究认为，β3-AR在CHF中起到保护作用[9]。由于样本量、检测方法、使用模型不同等原因，目前β3-AR对心功能的影响尚无明确定论，尚需要综合性更强并且更深入的研究来明确。心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成，非心肌细胞中90%以上由CFBs组成，其不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，在心脏间质纤维化过程中也发挥着重要作用[10]。因此，诱导CFBs中β3-AR过表达对研究β3-AR在心功能，尤其是在CHF进展中的影响及机制是很有必要的。

目前有许多方法诱导细胞目的基因过表达，包括目的基因过表达载体感染、药物干预等[11-12]。腺病毒和慢病毒是目前比较常用的病毒载体，腺病毒载体虽然感染率高，但是携带的目的基因不能整合至靶细胞基因组，表达时间短且不稳定，而以HIV-1为基础构建的新型慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组、长期稳定表达、免疫反应小、细胞毒性小等优点，是较为理想的基因转移载体[13]。因此，本研究组选择慢病毒感染使目的基因过表达，并对比其与药物诱导目的基因过表达的效果。结果显示，感染72 h时，各MOI组CFBs生长状态较好，细胞大多数呈梭形，无搏动性，细胞核较大，且肉眼观察荧光表达最佳；MOI 100组、MOI 200组感染率高于MOI 50组；MOI 200组感染率低于MOI 100组，提示MOI为100感染72 h是干预CFBs的最佳MOI；10-5mol/L组β3-AR表达水平高于10-6mol/L组、10-4mol/L组，提示10-5mol/L为β3-AR激动剂干预CFBs的最适浓度；10-5mol/L组、MOI 100组β3-AR表达水平高于正常对照组，提示慢病毒感染与β3-AR激动剂干预均能使CFBs中β3-AR过表达；MOI 100组β3-AR表达水平高于10-5mol/L组，提示慢病毒感染使CFBs中β3-AR过表达的效果优于β3-AR激动剂干预，这可能与药物对细胞内环境的影响有关。

目前国内外尚未见使用β3-AR过表达的慢病毒载体感染CFBs的实验方法，本研究组首次尝试使用携带β3-AR基因的慢病毒载体感染CFBs，在感染时间和处理方法上可能存在一些不确定因素，但本研究组在实验中进行了多次重复实验，尽可能将误差降至最低，以保证实验结果的真实性与可靠性。

综上所述，使用β3-AR过表达的慢病毒载体感染CFBs与β3-AR激动剂干预CFBs均可使其β3-AR过表达，且前者效果优于后者。CFBs β3-AR过表达模型的成功构建为今后在细胞水平观察β3-AR对心功能的影响提供新的实验方法，为临床治疗心力衰竭及心肌重构等提供了新思路、新方法，为进一步的研究提供相关的理论基础。

作者贡献：张源进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；张慧、马依彤、杨毅宁、马苗苗、朱晓丽进行实验实施、评估、资料收集；王丽进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔丽红)

Comparison of Two Methods of Building Cardiac Fibroblasts Models With β3-AR Overexpression

ZHANGYuan,WANGLi,ZHANGHui,etal.

DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China

【Abstract】ObjectiveTo build neonatal SD rat cardiac fibroblasts(CFBs) models with β3-AR overexpression by two different methods and compare the two methods so as to provide new experimental method for exploring the effect of β3-AR on heart function,especially on chronic cardiac failure.MethodsFrom March to June in 2015,8 SPF neonatal SD rats born 1 to 3 days ago were selected.CFBs of the rats were cultured in vitro and were randomly divided into three MOI groups which were MOI 50 group,MOI 100 group and MOI 200 group.These CFBs were infected by lentiviral vector with β3-AR overexpression,and infection rate was detected by flow cytometry to determine the optimal MOI.CFBs were randomly divided into four β3-AR agonist intervention groups which were normal control group,10-6mol/L group,10-5mol/L group,and 10-4mol/L group.Intervention was conducted on these CFBs by different concentrations of β3-AR agonist,and β3-AR expression level was detected by Western blotting method to find out the optimal concentration of β3-AR agonist in the intervention on CFBs.ResultsObserved under normal optics microscope,CFBs showed no pulsation and mostly took on fusiform shape,with large cell nucleus and transparent cytoplasm.The status of CFBs and fluorescent expression were observed under inverted fluorescence microscope at 24,48,72 and 96 h after infection.At 72 h,CFBs of each MOI group were in good growth status,they were mostly in fusiform shape and had no pulsation,with large cell nucleus,and the fluorescent expression observed by naked eye was optimal.MOI 100 group and MOI 200 group were higher than MOI 50 group in infection rate(P<0.05);MOI 200 group was lower than MOI 100 group in infection rate(P<0.05).10-6mol/L group,10-5mol/L group and 10-4mol/L group were higher than normal control group in the expression level of β3-AR(P<0.05);10-5mol/L group was higher than 10-6mol/L group and 10-4mol/L group in the expression level of β3-AR(P<0.05).10-5mol/L group and MOI 100 group were higher than normal control group in the expression level of β3-AR(P<0.05);MOI 100 group was higher than 10-5mol/L group in the expression level of β3-AR(P<0.05).ConclusionTwo methods of lentiviral vector and β3-AR agonists are both able to induce the overexpression of β3-AR in CFBs.By comparison,the method of lentiviral vector infection is better.

【Key words】Receptors,adrenergic,beta-3;Fibroblasts;Myocardium;Lentiviral vecto

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81260028)；石河子大学科学技术研究发展计划“自然科学与技术创新”团队创新项目(2011ZRKXTD-07)

作者单位：832008 新疆石河子市，石河子大学医学院第一附属医院心内科(张源，王丽，张慧，马苗苗，朱晓丽)；新疆医科大学第一附属医院心脏中心(马依彤，杨毅宁)

通信作者：王丽，832008 新疆石河子市，石河子大学医学院第一附属医院心内科；E-mail：mcmwl@163.com

【中图分类号】R 542.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.008

(收稿日期：2015-10-13；修回日期：2016-03-11)