nm23-H1和p53基因在子宫内膜异位症患者异位组织中的表达及意义

汪根莲，林爱琴，段仁杰，李铁臣,孙　青

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院　妇产科，安徽　芜湖　241001;2.皖南医学院　分子生物学研究室，安徽　芜湖 241002)



nm23-H1和p53基因在子宫内膜异位症患者异位组织中的表达及意义

汪根莲1，2，林爱琴2，段仁杰2，李铁臣2,孙青1

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院妇产科，安徽芜湖241001;2.皖南医学院分子生物学研究室，安徽芜湖 241002)

【摘要】目的：通过对子宫内膜异位症患者的异位内膜组织和正常对照组子宫内膜组织中nm23-H1基因和p53基因mRNA表达水平的研究，探讨nm23-H1基因和p53基因在子宫内膜异位症发生中的作用以及两基因表达的相关性。方法：收集30例子宫内膜异位症患者的异位内膜组织和30例正常对照组子宫内膜组织标本，用qRT-PCR方法检测nm23-H1基因和p53基因在两组中的表达，并分析两基因表达的相关性。结果：①相比于正常子宫内膜组织，nm23-H1基因和p53基因在异位内膜组织中的表达均下调，其表达差异具有统计学意义(t=2.575，P=0.015 vs t=2.708，P=0.011)。 ②nm23-H1基因和p53基因在子宫内膜异位症患者异位内膜组织中的表达有一定相关性(r=0.42，P=0.02)。结论：nm23-H1基因和p53基因mRNA表达水平的下降可能与子宫内膜异位症的发生、发展相关。nm23-H1基因可能通过p53途径导致子宫内膜异位症的发生，其确切机制仍有待进一步研究。

【关键词】子宫内膜异位症；nm23-H1；p53；real-time qPCR

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.002

子宫内膜异位症是常见的妇科疾病[1～2]，育龄妇女中的发病率约为10%[1-2]，患者主要表现为慢性盆腔疼痛、痛经等症状[1-3]，其中近一半的患者合并不孕症[2-3]。该病虽然是一种良性疾病，却具有恶性肿瘤浸润和转移的特点[3-4]，因而可能具有与癌症相类似的发病机制，某些抑癌基因和肿瘤转移抑制基因可能参与该病的发生与发展。nm23-H1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，与多种肿瘤的转移潜能负相关；p53基因是迄今发现与肿瘤发生最相关的基因，人类50%的癌症出现该基因的突变和表达异常。

本研究采集子宫内膜异位症患者的异位内膜组织和正常对照组织标本各30例，运用qRT-PCR方法检测两组间nm23-H1基因和p53基因的表达，比较两基因在子宫内膜异位症组和正常对照组中的表达差异及分析两基因表达之间的关联性，探讨抑癌基因和肿瘤转移抑制基因在内异症发生中的作用及其机制。

1资料与方法

1.1临床资料30例子宫内膜异位症组织标本来自2014年9月～2015年3月皖南医学院附属弋矶山医院妇产科经开腹或腹腔镜手术切除标本，均为卵巢巧克力囊肿，患者无特殊疾病史，术前3个月内未采用过激素治疗，年龄24～49岁，平均年龄(34±4.6)岁。30例对照组标本为同期妇产科门诊行诊断性刮宫的育龄妇女的正常子宫内膜，均为增生期子宫内膜，患者年龄25～50岁，平均年龄(42±3.5)岁。

以上所有标本均经镜下病理检查证实。术中无菌条件下采集组织标本后置于存有样本保存液的无菌无RNA酶的离心管内,4℃冰箱过夜后转入干燥离心管中，-20℃低温冰箱保存，用于后续实验。

1.2实验方法

1.2.1总RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen，美国 )一步法常规提取组织总RNA。紫外分光光度计检测总RNA浓度与纯度，将RNA的终浓度调至1 μg/μL。随后逆转录合成cDNA，反应总容量30 μL，先配制混合液A(容量14 μL)：3 μL Oligo dT(15)(Promega公司)、2 μL RNA、9 μL ddH2O,混匀、离心，70℃反应5 min，迅速置于冰上3 min，然后加入混合液B(容量16 μL):5×RT buffer 6 μL、M-MLV 1 μL、dNTPs 1.5 μL(均为Promega公司产品)、RNasin 0.5 μL、ddH2O 7 μL。42℃反应 60 min后,95℃ 5 min灭活反转录酶,反转录产物置于-20℃冰箱保存或立即进行下游实验。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)根据文献 合成p53基因引物序列，使用NCBI数据库进行nm23-H1和β-actin序列的查找，采用Primer 5.0进行引物设计，引物由上海捷瑞生物有限公司合成，序列见表1。用qRT-PCR方法对子宫内膜异位症异位内膜组织和正常子宫内膜组织中的nm23-H1和p53表达进行定量检测。qRT-PCR反应采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR 试剂盒进行，体系12 μL，置于ABI-7500 PCR仪上50℃ 2 min，95℃ 10 min 后95℃15 s、60℃1 min共40循环。以β-actin为内参，用2-△△CT法计算相对定量结果。

表1qPCR实验中的引物序列(5′→3′)

基因引物序列片段大小/bpβ-actinF-CTCCATCTGGCCTCGCTGT267R-GCTGTCACCTTCACCGTTCCnm23-H1F-GACCGTCCATTCTTTGCC93R-GCCCGTCTTCACCACATTp53F-AGGCCTTGGAACTCAAGGAT85R-CCCTTTTTGGACTTCAGGTG

2结果

2.1nm23-H1基因在子宫内膜异位症中的表达nm23-H1基因在子宫内膜异位症组和正常对照组中mRNA表达水平分别为0.67±0.29和1.23±1.15，子宫内膜异位症异位内膜组织中nm23-H1的mRNA表达水平低于正常对照组，差异有统计学意义(t=2.575，P<0.05)，见表2。

2.2p53基因在子宫内膜异位症中的表达p53基因在子宫内膜异位症和正常对照组中的mRNA表达水平分别为0.51±0.42和1.62±2.2，子宫内膜异位症异位内膜组织中p53基因的mRNA表达低于正常对照组，差异有统计学意义(t=2.708，P<0.05)，见表2。

表2子宫内膜异位症组和正常对照组中nm23-H1基因和p53基因mRNA表达强度的比较

组别nnm23-H1p53对照组301.23±1.151.62±2.2病例组300.67±0.290.51±0.42

2.3nm23-H1和p53基因表达的相关性子宫内膜异位症异位内膜组织中nm23-H1基因和p53基因mRNA表达水平均下调，两者在子宫内膜异位症患者的异位内膜组织中的表达有一定的相关性(r=0.42，P=0.02)，正常对照组中nm23-H1基因和p53基因的表达无相关性(r=0.093，P=0.62)。

3讨论

子宫内膜异位症是极具侵袭性和复发性、严重影响妇女健康和生活的妇科疑难病，目前致病机制仍不明确[1-3]。该病虽然是一种良性疾病，却具有恶性肿瘤浸润和转移的特点，因而可能具有某些与癌症相类似的发病机制，一些肿瘤转移抑制基因在疾病的发生、发展中可能发挥一定的作用。

nm23基因是第一个被发现的肿瘤转移抑制基因。已知nm23基因家族有10个成员：H1～H10，其中nm23-H1与肿瘤转移关系密切[8-9]。研究证实nm23-H1基因与多种肿瘤的转移潜能负相关，与病人生存期正相关[8-10]。其抑制肿瘤转移的机制尚不明确[8-11]。

nm23-H1基因在子宫内膜异位症中的作用研究不多，Schneider等[12]的研究发现，在16例盆腔子宫内膜异位症患者中仅7例表达了nm23蛋白(阳性率为43.7%)，本实验室前期研究结果[13]也显示子宫内膜异位症中nm23-H1的mRNA和蛋白表达水平均低于各自的正常子宫内膜对照组。本研究表明，nm23-H1基因在子宫内膜异位症异位内膜组织中的表达下调，低于正常对照组，这与Schneider等及本实验室前期研究结果一致，表明nm23-H1基因与子宫内膜异位症的发生有一定的关联。

p53基因是迄今发现与肿瘤发生最相关的基因，野生型p53基因是重要的肿瘤抑制基因，参与细胞周期调控，与细胞增殖、凋亡相关。p53基因的突变和表达异常频繁出现在人类多种癌症中。p53基因是否在子宫内膜异位症中发挥作用仍是不明确的。Schneider等[12]使用免疫组织化学方法在子宫内膜异位症中未检测到p53的表达。Govatati等[14]研究表明，子宫内膜异位症患者异位内膜p53基因表达下调与印度妇女子宫内膜异位症发病风险相关。本研究发现异位内膜组织中p53基因mRNA表达水平低于正常对照组，该基因表达的异常可能是子宫内膜异位症发病的一个重要机制。

Jung等[15]研究表明nm23-H1可直接与p53相互作用，增加p53核易位(nuclear translocation)，从而激活p53的功能。而p53基因作为雌激素受体的负性调控因子可能通过类固醇信号通路间接调节nm23-H1的表达[16]]。本实验发现子宫内膜异位症异位内膜组织中nm23-H1基因和p53基因mRNA表达水平均下调，两者在子宫内膜异位症患者的异位内膜组织中的表达有一定的相关性，而在正常对照组中两者表达无相关性。子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病[1-3]，研究表明[17]]雌、孕激素可通过PIK3/Akt通道调节nm23-H1的表达。激素的改变可能通过影响nm23-H1基因的表达导致子宫内膜异位症的发生。在体内高雌激素水平下，nm23-H1基因和p53基因可能相互协同、相互作用，共同促进子宫内膜异位症的发生。

子宫内膜异位症是多因素疾病，其发生、发展是一个复杂的过程,肿瘤转移抑制基因和抑癌基因的表达失调可能在其中发挥重要的作用，对nm23-H1基因在子宫内膜异位症发生中的作用及其机制的研究可能为子宫内膜异位症的发病机制和临床治疗手段提供新的思路和分子标靶。

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Expression and implication of nm23-H1 and p53 gene in endometriosis

WANG Genlian,LIN Aiqin,DUAN Renjie,LI Tiechen,SUN Qing

Department of Obstetrics and Gynecology,The first Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To investigate the mRNA expression level of nm23-H1 and p53 gene in subjects with normal endometrium or endometriosis for clarifying the roles of the two genes in the pathogenesis and development of endometriosis.Methods:Endometrium samples were retrospectively obtained from healthy women(n=30)and patients with endometriosis(n=30).Real-time quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression level of nm23-H1 and p53 gene in the two groups,and the relationship between the two genes were analyzed.Results:By comparison with the normal endometrial tissues,patients with endometriosis had down-regulated mRNA expression levels of nm23-H1 and P53 gene(t=2.575,P=0.015 vs t=2.708,P=0.011)in which the two genes were correlated to a certain extent(r=0.42,P=0.02).Conclusion:Down-regulated levels of nm23-H1 gene and p53 gene may be associated with the occurrence and development of endometriosis,and nm23-H1 gene leading to endometriosis may be involved in the alteration of p53.However,the exact mechanism remains to be further clarified.

【Keywords】endometriosis;nm23-H1;p53;real-time quantitative PCR

文章编号：·基础医学·1002-0217(2016)01-0005-03

基金项目：安徽省高校省级自然科学研究重点项目(KJ2014A267)

收稿日期：2015-07-02

作者简介：汪根莲(1981-)，女，2013级硕士研究生，(电话)13605632467，(电子信箱)2603542847@qq.com;

【文献标识码】【中图号】R 711.71A

孙青，女，副主任医师，副教授，硕士生导师，(电子信箱)sunqingl@126.com,通讯作者.