1型糖尿病模型大鼠Meynert基底核神经元凋亡及Bax与Bcl-2的蛋白表达

王　薇，赵　健，郭　灵

(1.皖南医学院　解剖学教研室，安徽　芜湖　241002；2.广西医科大学　解剖学教研室，广西　南宁　530021)



1型糖尿病模型大鼠Meynert基底核神经元凋亡及Bax与Bcl-2的蛋白表达

王薇1，赵健1，郭灵2

(1.皖南医学院解剖学教研室，安徽芜湖241002；2.广西医科大学解剖学教研室，广西南宁530021)

【摘要】目的：观察1型糖尿病模型大鼠脑内Meynert基底核神经元凋亡以及凋亡相关因子Bax与Bcl-2的蛋白表达，探索1型糖尿病中枢神经系统功能障碍的发生机制。方法：将24只成年健康Wistar大鼠随机分为糖尿病组、载体组和正常组。腹腔注射溶于pH 4.4柠檬酸缓冲液的链脲佐菌素，建立1型糖尿病模型大鼠；载体组大鼠腹腔注射等体积的pH 4.4柠檬酸缓冲液；正常组不进行任何处理。应用TUNEL反应技术和免疫组织化学方法，检测各组大鼠脑Meynert基底核神经元凋亡及凋亡相关因子Bax与Bcl-2基因的蛋白表达情况。结果：1型糖尿病大鼠脑Meynert基底核的Bax、TUNEL阳性细胞数明显高于正常组和载体组(P<0.01)，但Bcl-2阳性细胞数明显低于正常组和载体组(P<0.01)。结论：1型糖尿病能引起Meynert基底核中神经元的凋亡及凋亡因子Bax的蛋白表达增加，同时使抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达减少。

【关键词】1型糖尿病；细胞凋亡；Bax；Bcl-2；Meynert基底核

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.001

1型糖尿病是由于胰岛β细胞破坏导致胰岛素的绝对不足进而引起血糖升高的一种疾病。而胰岛素作为一种神经营养因子，缺乏时常损害到脑内的神经细胞，导致中枢神经系统功能障碍[1-2]。目前，1型糖尿病引起中枢神经系统功能障碍的研究日益受到关注，但其机制尚不清楚。研究表明，Meynert基底核内有大量的胆碱能神经元，它发出的纤维投射到整个大脑新皮质和杏仁体。并且有实验证明，破坏Meynert基底核可引起明显的中枢神经系统功能障碍[4-5]。目前有关1型糖尿病是否引起Meynert基底核胆碱能系统神经元凋亡的研究甚少，因此本实验通过观察1型糖尿病大鼠脑内Meynert基底核是否有细胞凋亡发生及凋亡相关因子Bax和Bcl-2蛋白表达水平的变化，来探索1型糖尿病中枢神经系统功能障碍的发生机制。

1材料与方法

1.1实验动物成年健康雄性Wistar大鼠24只，体质量180～220 g，由广西医科大学医学实验动物中心提供。

1.2主要试剂及仪器链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自Sigma公司；Bax与Bcl-2抗体、SP试剂盒、DAB显色液及原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；One Touch Ⅱ血糖仪与Genuine血糖试纸均购自美国强生公司；江湾Ⅰ型C大鼠立体定位仪购自上海川沙花木农机厂。

1.3实验分组及模型建立将24只Wistar大鼠随机分成3组：糖尿病组、载体组和正常组，每组8只。糖尿病组：按已报道的方法，每10mg STZ溶解于1 mL的pH 4.4柠檬酸缓冲液中配置混合溶液，大鼠禁食24 h后，按5.5 mL/kg腹腔注射刚配制的混合溶液建立1型糖尿病大鼠模型。5 d后测定大鼠空腹血糖，以血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作为模型成功标准；载体组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液；正常组大鼠不作任何处理。

1.4TUNEL及免疫组织化学染色法1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏和升主动脉，4%多聚甲醛灌注固定，开颅后将大鼠正确地置于大鼠脑立体定位仪上，取出含有Meynert基底核的节段，固定24 h，石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，切片常规脱蜡至水。按照试剂公司提供的相应说明书分别进行TUNEL、Bax和Bcl-2的反应和显色步骤。阴性对照反应用PBS替代相应的一抗。常规脱水、透明，中性树胶封片。

1.5细胞计数参照大鼠脑立体定位图谱，在光镜下对每只大鼠选择相同脑冠状切面各3张作为观察对象，分别观察分析并记录相应的TUNEL、Bax和Bcl-2阳性细胞数。

2结果

2.1各组大鼠血糖水平的变化与载体组和正常组比较，糖尿病组大鼠的血糖水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；但载体组和正常组相比较，两组之间的血糖水平接近，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别血糖水平/(mmol/L)糖尿病组19.31±2.73*△载体组6.25±1.67正常组6.23±1.27F值115.394P值0.00

注：与载体组比较*P<0.01；与正常组比较△P<0.01。

2.2各组大鼠Meynert基底核Bax、Bcl-2及TUNEL阳性细胞的分布免疫组织化学结果显示，TUNEL、Bax及Bcl-2阳性产物均呈棕黄色，TUNEL主要表达于细胞核，而Bax或Bcl-2主要表达于细胞浆。各组Meynert基底核中均可见TUNEL、Bax和Bcl-2阳性细胞，细胞轮廓清晰可见。阴性对照不显色。

与载体组和正常组比较，糖尿病组Meynert基底核的Bax和TUNEL阳性细胞数显著增加，而Bcl-2阳性细胞数则显著下降，各组间的数据差异均有统计学意义(P<0.01)。但载体组与正常组相比较，各组数据均无统计学意义(P>0.05)。 见表2、图1。

组别BaxBcl-2TUNEL细胞数/(个/高倍视野)灰度值细胞数/(个/高倍视野)灰度值细胞数/(个/高倍视野)灰度值糖尿病组38.83±5.35*△138.66±12.80*△21.85±4.44*△168.94±7.69*△39.13±3.56*△69.50±12.97*△载体组19.88±3.06172.19±10.0939.31±3.75140.06±5.4719.88±2.80122.62±4.16正常组18.96±3.94171.25±4.9438.84±4.80132.11±5.6919.63±4.07122.44±8.80F值56.39130.16341.82770.67280.98085.583P值0.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：与载体组比较*P<0.01；与正常组比较△P<0.01。

A1、B1、C1分别为糖尿病组、载体组和正常组Bax阳性细胞的分布； A2、B2、C2分别为糖尿病组、载体组和正常组Bcl-2阳性细胞的分布；

A3、B3、C3分别为糖尿病组、载体组和正常组TUNEL阳性细胞的分布。

图1各组大鼠Meynert基底核Bax、Bcl-2和TUNEL阳性细胞(免疫组织化学染色×400)

3讨论

凋亡相关基因可分为抗凋亡和促凋亡两大类，其中最经典的代表分别为Bax与Bcl-2，他们在线粒体介导的内源性细胞凋亡通路中发挥着重要作用。在正常情况下，Bax与Bcl-2之间保持一定的比例，并以Bcl-2/Bax异源二聚体的形式存在，从而抑制凋亡，维持着细胞的生存；而病理原因可以诱导Bax的高表达，Bcl-2的低表达，增加Bax同源二聚体的形成，Bcl-2与Bax之间的比例下降，便促使细胞凋亡的发生。因此Bax与Bcl-2两者的比值大小决定了细胞是否启动凋亡信号或者是否能进入凋亡的状态。在凋亡早期，细胞就发生了DNA的断裂，而TUNEL细胞凋亡检测法就是检测DNA断裂点的凋亡定量检测方法，能够较早检测到细胞凋亡的发生[10]。综上所述，本研究采用TUNEL、Bax和Bcl-2作为凋亡检测指标来观察1型糖尿病大鼠Meynert基底核中细胞凋亡及凋亡基因蛋白表达的变化是相对合理的。

胰岛β细胞凋亡加速引起胰岛素分泌绝对不足是1型糖尿病发病的主要原因。研究发现，胰岛素是中枢神经系统主要的神经生长因子和神经营养因子，具有保护神经元的发育生长、促进神经递质的合成和阻止细胞凋亡发生的功能，所以胰岛素的缺乏便有可能导致神经元功能失常，诱导细胞凋亡的发生[11]。另外，1型糖尿病引起的持续性高血糖可以通过一系列的连锁反应，如降低Na+-K+-ATP酶的活性、阻止营养物质的运输、使脑血管壁增厚、促进脑血栓形成等负性因素导致脑组织缺血以及结构功能的损害[12-13]。

Meynert基底核内聚集的胆碱能神经元参与觉醒、学习和记忆等多种生理功能[3-5]。当这些胆碱能神经元减少时，胆碱乙酰转移酶活性降低，神经递质乙酰胆碱的合成和释放减少，向大脑皮质发出的兴奋性神经冲动减少，势必会影响到中枢神经系统的正常功能，继而引起中枢神经系统功能障碍[14-15]。那么1型糖尿病能否改变凋亡相关基因Bax和Bcl-2的蛋白表达，继而诱发Meynert基底核神经元凋亡值得探讨。因此，本研究建立了1型糖尿病模型并进行了相关实验，其结果显示：在400倍光学显微镜下观察Meynert基底核，发现1型糖尿病组的TUNEL、Bax阳性细胞数均较载体组和正常组显著增加(P<0.01)；而Bcl-2阳性细胞数则较载体组和正常组显著降低(P<0.01)，据此推测1型糖尿病导致的胰岛素缺乏和高血糖使Bax基因表达上调，而Bcl-2基因表达下调，促使凋亡程序的启动，Meynert基底核内的胆碱能神经元进入凋亡状态，大量神经元自发性死亡，导致神经元数量锐减，进而干扰中枢神经系统正常功能，最终导致中枢神经系统功能障碍的发生。

综上所述，凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2在Meynert基底核内表达失调引起的神经元凋亡在1型糖尿病中枢神经系统功能障碍的发生发展过程中可能扮演着重要的角色，但两种凋亡相关基因对1型糖尿病Meynert基底核神经元进行调控的分子机制尚未完全明确，需要进一步深入研究。

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Neuron apoptosis and Bax/Bcl-2 protein expression in the nucleus basalis of Meynert in rats with type 1 diabetes

WANG Wei,ZHAO Jian,GUO Ling

Department of Anatomy,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To observe neuron apoptosis and Bax and Bcl-2 protein expression in the nucleus basalis of Meynert in rats with type 1 diabetes for exploring the mechanisms of central nervous system dysfunction in type 1 diabetes.Methods:Twenty-four Wistar rats were randomized into group of diabetes,vehicle and normal.Type 1 diabetic model rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin dissolved in citrate buffer solution(pH4.4).Rats in vehicle group were given equal volume of the same buffer,and normal controls were free of any treatment.Terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated-dUTP nick and labeling(TUNEL)technique and immunohistochemical methods were used to detect the neuron apoptosis in the nucleus basalis of Meynert in each group of rats.Results:The number of Bax immunereactive(Bax-IR)neurons and TUNEL-positive neurons in the nucleus basalis of Meynert was significantly higher,yet the count of Bcl-2 IR neurons was markedly lower,in type 1 diabetic group than the vehicle and normal groups(P<0.01).Conclusion:Type 1 diabetic rats may be complicated with apoptosis of nucleus basalis of Meynert and up-regulated Bax expression,yet decrease of Bcl-2 protein expression.

【Keywords】type 1 diabetes;cell apoptosis;Bax;Bcl-2;nucleus basalis of Meynert

文章编号：·基础医学·1002-0217(2016)01-0001-04

基金项目：皖南医学院中青年科研基金项目(WK201108)

收稿日期：2015-07-24

作者简介：王薇(1985-)，女，助教，(电话)15955389737，(电子信箱)wangweiaqhn@163.com；

【文献标识码】【中图号】R 587.1A

郭灵，男，教授，(电子信箱)drguolinggx@aliyun.com，通讯作者.