正天丸对偏头痛大鼠三叉神经节P2X3受体表达的影响*

白方会,　李　慧，　任志军，　刁建新，　邱爱珠，　陈宝田△

(1南方医科大学，广东 广州 510515； 2暨南大学医学院附属广州红十字会医院中医科，广东 广州 510220； 3湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412000)



正天丸对偏头痛大鼠三叉神经节P2X3受体表达的影响*

白方会1,李慧2，任志军1，刁建新1，邱爱珠3，陈宝田1△

(1南方医科大学，广东 广州 510515；2暨南大学医学院附属广州红十字会医院中医科，广东 广州 510220；3湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412000)

[摘要]目的： 探讨正天丸对偏头痛大鼠三叉神经节P2X3受体表达的影响。方法: SD大鼠随机分为对照组、偏头痛组、正天丸组和抑制剂(A-317491)组。给药7 d后，偏头痛组、正天丸组和抑制剂组硝酸甘油(10 mg/kg)皮下注射建立偏头痛大鼠模型，对照组注射等量生理盐水。观察各组大鼠行为学表现，造模4 h后取材，采用免疫荧光、Western blot和实时荧光定量PCR方法观察各组大鼠三叉神经节中P2X3受体表达的变化。结果: 造模后5 min左右各组均出现挠头、爬笼等行为学表现，对照组大鼠仅开始30 min内出现挠头和爬笼现象，无耳红表现，大约2 h 后正天丸组和抑制剂组头痛行为学表现停止，偏头痛组大鼠在造模后3 h左右停止。偏头痛组和对照组相比较，大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)中P2X3受体蛋白和mRNA表达均明显升高(P<0.05)；正天丸组大鼠TG中P2X3受体蛋白和mRNA表达均明显低于偏头痛组(P<0.01)；正天丸组和抑制剂组相比，大鼠TG中P2X3受体蛋白和mRNA表达无明显差异。结论: 正天丸可抑制偏头痛发作时TG中P2X3受体的过表达，从而发挥抗偏头痛的作用。

[关键词]正天丸； 三叉神经节； P2X3受体； 偏头痛

偏头痛以发作性单侧或双侧头部中、重度搏动样头痛为特点，常伴有恶心、呕吐，声、光刺激和日常活动均可使头痛加重。最新流行病学调查显示我国偏头痛年患病率为9.3%[1]，偏头痛目前治愈率较低，致残率高，给社会和家庭带来较大经济负担，并严重影响患者的生活质量。三叉神经血管系统的激活和致敏是偏头痛发生的关键环节[2]，嘌呤能受体P2X3受体属于P2X亚家族之一(P2X1～7)[3]，为一种配体门控性非选择性阳离子通道，可以被细胞外ATP所激活，选择性高表达于与疼痛相关的感觉神经元上，在三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)大、中、小直径神经元均有丰富表达[4]。偏头痛发作时，三叉神经P2X3受体作为重要的痛觉信息传递介质，表达明显上调[5]。正天丸作为治疗偏头痛的常用中成药之一，临床疗效确切且安全性较好，但其作用机制尚缺乏深入探讨。本实验通过观察正天丸对偏头痛模型大鼠TG中P2X3受体表达的影响，以探讨其对偏头痛的防治机制。

材料和方法

1实验动物、分组和偏头痛模型的建立

雄性SD大鼠体重(280±20)g，40只，由南方医科大学实验动物中心提供。按照随机数字表法将大鼠分为对照组、偏头痛组、正天丸组和抑制剂组(A-317491组)，每组10只，4只用于免疫荧光检测，3只用于Western blot检测，3只用于实时荧光定量PCR。正天丸组给予正天丸灌胃，剂量为1.62 g·kg-1·d-1(药物剂量根据成人常规每日口服剂量进行换算)，抑制剂组给予A-317491腹腔注射，剂量为0.5 mg/kg(生理盐水溶解)，对照组和偏头痛组大鼠给予生理盐水灌胃(1 mL/d)。各组大鼠连续给药 7 d。偏头痛组、正天丸组、抑制剂组大鼠末次灌胃30 min后左肩部皮下注射硝酸甘油注射剂(10 mg/kg)，制备实验性偏头痛动物模型，对照组大鼠同期左肩部皮下注射生理盐水 0.5 mL[6]。造模4 h后取材。

2实验药物与试剂

硝酸甘油注射液，北京益民药业有限公司；正天丸，华润三九医药股份有限公司；P2X3受体抗体(Santa Cruz)；A-317491(Sigma)；免疫荧光 II 抗-山羊抗兔Cy3(南京凯基生物科技发展有限公司)；β-actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCA试剂盒和ECL发光液(碧云天试剂有限公司)；PVDF膜(Millipore)；TRIzol(Invitrogen)；PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)；SyBrI荧光定量试剂盒、MX3005P荧光定量PCR仪(Stratagene)；IS 2000 MM图像工作站(Kodak)。

3实验方法

3.1症状行为学观察观察造模后各组大鼠耳红、挠头、爬笼、烦躁不安等症状出现时间、持续时间和各时段内挠头、爬笼次数。出现以上行为学表现视为造模成功[7]。采用持续时间分段计数的方法，以每30 min作为一个时段进行观察，根据预实验情况，确定本实验观察时间持续至造模后3 h。头痛开始以造模后连续挠头次数超过5次为标志，预示着造模成功，头痛消失以30 min内挠头次数低于5次为标志。

3.2免疫荧光法观察P2X3受体的表达造模4 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，先快后慢，灌注至大鼠尾巴变僵硬。断头取双侧TG，放入4%多聚甲醛固定24 h，次日依次放入10%、20%、30%蔗糖脱水至沉底。石蜡包埋切片，片厚约5 μm。切片依次进行烤片、脱蜡、水化、热抗原修复、灭活内源性过氧化物酶后，滴加5% BSA封闭液封闭，37 ℃恒温箱中孵育15 min以封闭非特异性抗原。加入 I 抗P2X3受体兔多克隆抗体(1∶500)，4 ℃环境下孵育过夜；PBS漂洗5 min 3次，滴加荧光 II 抗抗兔Cy3(1∶500)，避光孵育1 h， PBS漂洗5 min 3次，加抗淬灭剂，中性树胶封片，倒置荧光显微镜下观察结果，红色荧光颗粒为标记的P2X3受体，用图像分析软件分析P2X3受体阳性神经元的光密度值变化，对照组以PBS代替 I抗。

3.3Western blot测定P2X3受体蛋白的表达大鼠过深麻醉处死，冰上分离双侧TG，-80 ℃保存。等量混合组内所有样品，取混合物50 mg进行液氮研磨，加入150 μL RIPA裂解液及1.5 μL PMSF冰上裂解30 min，1 500 r/min, 4 ℃离心15 min。取上清液，BCA法测蛋白浓度。取样本50 μg进行SDS-PAGE分离，转于PDVF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST冲洗3次，加入P2X3兔多克隆 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST冲洗3次，HRP偶联的山羊抗兔 II 抗(1∶3 000)室温孵育l h，ECL化学发光法用IS 2000 MM成像系统进行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0(Kodak)软件分析条带灰度值，以β-actin为内参照，标化各组P2X3受体的蛋白表达量，样品重复检测3次，取均值。

3.4实时荧光定量PCR测定P2X3受体的mRNA表达大鼠过深麻醉处死，冰上分离双侧TG，-80 ℃保存。按照试剂盒说明书进行各样本总RNA的提取，以Oligo(dT)为引物逆转录RNA为cDNA，逆转录条件为25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。以GAPDH为内参照，检测P2X3受体的mRNA表达。引物自行设计，由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列如下：P2X3的上游引物序列为5’-TCTTGAGGGTAGGGGATGTG-3’，下游引物序列为5’-CACACCCAGCCGATCTTAAT-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-ATTCTCAGCAATGCATCGAC-3’，下游引物序列为5’-ATGGACTGTGGtcATGAGCT-3’。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL(dH2O 7 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、Taq酶10 μL)。PCR反应条件为95 ℃ 10 s;95 ℃ 10 s,58 ℃ 5 s,72 ℃10 s,共45个循环。PCR仪读取内参照GAPDH和P2X3的循环阈值，采用相对定量法(2-ΔΔCt)计算各样本P2X3受体mRNA相对表达量。

4统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，首先进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析，不齐时采用Welch近似方差分析法进行组间比较;与固定一组进行比较时，采用两独立样本的t检验；整体组间比较有差异时，进一步采用Bonferroni 校正的t检验法(方差齐时用)或Dunnett’s T3法(方差不齐用)进行各组均数的多重比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1各组大鼠行为学表现

造模后5 min左右，对照组大鼠除开始30 min内挠头和爬笼现象稍明显外，其余时段未见明显异常活动，无耳红表现。其余各组大鼠均出现双耳发红，频繁挠头、爬笼及烦躁不安等现象，此现象在造模后30～60 min达高峰，大约2 h 后正天丸组和抑制剂组大鼠出现活动明显减少，精神不振，蜷卧于观察箱的一角，偏头痛组大鼠在造模后3 h左右活动减少，蜷卧不动。

2免疫荧光观察

免疫荧光结果显示，各组大鼠TG神经元均有不同程度P2X3受体阳性表达(图中红色荧光颗粒)，偏头痛组表达亮度明显较对照组高，正天丸组和抑制剂组表达亮度较偏头痛组降低。各组的阳性神经元光密度值如下：对照组为0.156 6±0.012 6，偏头痛组为0.331 9±0.024 3，正天丸组为0.167 3±0.011 8，抑制剂组为0.164 0±0.017 9。偏头痛组P2X3受体表达较对照组升高(P<0.05)，正天丸组和抑制剂组P2X3受体表达低于偏头痛组(P<0.05)，正天丸组和抑制剂组之间比较差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1.The effects of Zhengtian pills (ZTP) on the expression of P2X3receptor in the TG of each group observed by immunofluorescence (×200).

图1各组大鼠TG中P2X3受体的表达

3Western blot测定P2X3受体蛋白表达的结果

各组大鼠TG神经元P2X3受体蛋白表达结果显示，P2X3/β-actin的比值如下：对照组为0.38±0.04,偏头痛组为0.95±0.04,正天丸组为0.59±0.02,抑制剂组为0.61±0.04。偏头痛组P2X3受体蛋白表达较对照组明显增加(P<0.05)，正天丸组P2X3受体蛋白表达较偏头痛组明显降低(P<0.01)，正天丸组P2X3受体蛋白表达与抑制剂组比较差异无统计学显著性,见图2。

Figure 2.The effects of ZTP on the protein expression of P2X3receptor in the TG determined by Western blot. Mean±SD. n=3.##P<0.01 vs model group.

图2各组大鼠TG中P2X3受体蛋白的表达

4实时荧光定量PCR测定P2X3受体的mRNA表达结果

实时荧光定量PCR结果显示，各组大鼠TG上P2X3受体的mRNA表达水平如下：对照组为1.00±0.01、偏头痛组为1.84±0.14、正天丸组为1.40±0.22、抑制剂组为1.29±0.16。偏头痛组大鼠TG上P2X3受体的mRNA表达较对照组明显增加(P<0.01)，给予正天丸治疗后偏头痛大鼠TG上P2X3受体的mRNA表达较偏头痛组明显降低(P<0.01)，正天丸组P2X3受体的mRNA表达与抑制剂组比较差异无统计学显著性，见图3。

Figure 3.The effects of ZTP on the mRNA expression of P2X3receptor in the TG of each group by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.##P<0.01 vs model group.

图3各组大鼠TG中P2X3受体的mRNA表达

讨论

行为学表现是评价硝酸甘油偏头痛大鼠模型造模成功的一项重要指标[8]，本实验给予大鼠皮下注射硝酸甘油5 min左右即出现双耳发红、频繁挠头、爬笼及烦躁不安等现象，说明我们成功复制了偏头痛模型。我们的结果显示偏头痛组大鼠的挠头、爬笼等行为学表现持续了3 h左右，表明我们所造的偏头痛模型的头痛呈一定的持续状态，与文献报道和偏头痛患者临床表现相符合[9]。给予特异性P2X3受体抑制剂A-314791治疗后，患者的行为学表现持续时间明显缩短，说明P2X3受体确实参与了偏头痛的发病过程，正天丸治疗后头痛症状明显改善，佐证了其可能通过抑制P2X3受体的表达起作用。

三叉神经血管系统的激活和致敏是偏头痛发生的关键环节。TG作为三叉神经血管系统的重要部位，其周围突分布在头、面部以及颈部，将收集到的痛觉信息通过其中枢突传递至三叉神经二级神经元——三叉神经脊束核尾部，进一步向中枢传递[10]。P2X3受体选择性高表达于处理伤害性信息的感觉神经元上[11]，具有较高的Ca2+通透性，可以介导包括偏头痛在内的多种急慢性疼痛，已成为疼痛治疗领域的新靶点[12]。P2X3受体在TG神经元有丰富表达，支配硬脑膜的TG神经元有43%呈P2X3免疫阳性[13]。激活三叉神经感觉神经元的P2X3受体可引起Ca2+内流，增加兴奋性神经递质谷氨酸释放以加强兴奋性突触传递，并介导炎症反应的中枢敏化[14]。应用偏头痛转基因模型研究显示，P2X3受体在野生型小鼠感觉神经元基础表达较低，但在家族性偏瘫型偏头痛Ⅰ型转基因模型小鼠三叉神经感觉神经元呈组成型上调状态[15]；P2X3受体在硝酸甘油偏头痛大鼠模型TG呈高表达状态[16]，以上报道充分证实了三叉神经感觉神经元P2X3受体表达上调与偏头痛发作有明显相关性[17]。本实验应用免疫荧光和Western blot技术检测各组大鼠TG中P2X3受体蛋白的表达，实时荧光定量PCR技术检测各组大鼠TG中P2X3受体mRNA的表达，结果显示对照组与模型组大鼠TG中均有P2X3受体蛋白和mRNA的阳性表达，但对照组表达较低，与对照组相比模型组大鼠TG中P2X3受体蛋白和mRNA的表达明显升高，说明在正常状态下TG中既有少量P2X3的表达，我们对大鼠皮下注射硝酸甘油成功建造了偏头痛动物模型，激活了三叉神经血管系统，硝酸甘油可以通过上调TG中P2X3的表达从而介导偏头痛的发作，与文献报道一致[5]。

偏头痛属于中医学“头痛”、“头风”范畴，其病因病机可概括为风、湿、瘀、虚4个方面。正天丸正是根据此病因病机，由导师陈宝田教授于1985年创制而成，该方由川芎、钩藤、白芍、生地黄、当归、桃仁、红花、白芷、麻黄、附子、细辛、防风、羌活、独活、鸡血藤等中药组成，具有疏风活血、养血平肝、通络止痛等功效，是目前临床治疗偏头痛的常用中成药之一[18]，已在临床应用20多年，并已远销海外。临床随机对照双盲多中心研究显示，正天丸能显著减轻偏头痛的发作强度、程度，降低发作频率，缩短头痛持续时间，临床疗效确切，病人耐受性好，且无明显不良反应[19]。实验研究显示正天丸对偏头痛大鼠症状行为学的改善有类似氟桂利嗪样作用[8]，正天丸的镇痛作用与其可以升高实验动物血及脑干中5-羟色胺水平，降低血浆中降钙素基因相关肽、一氧化氮含量等多种疼痛递质有关[8, 20]。本研究结果显示，与偏头痛组相比，正天丸组和抑制剂组大鼠TG中P2X3受体mRNA和蛋白表达水平均明显降低，正天丸组和抑制剂组之间比较无差异，说明正天丸可以通过抑制偏头痛发作时TG中P2X3受体的过表达从而发挥抗偏头痛的作用，从而为正天丸治疗偏头痛的作用机制提供了新的依据。

[参考文献]

[1]Yu S, Liu R, Zhao G, et al. The prevalence and burden of primary headaches in China: a population-based door-to-door survey[J]. Headache, 2012, 52(4):582-591.

[2]Goadsby PJ, Charbit AR, Andreou AP, et al. Neurobiology of migraine[J]. Neuroscience, 2009, 161(2):327-341.

[3]苏程程，张译丹，马永强，等. 干扰P2X7R基因对RAW264.7细胞增殖和吞噬的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(11):2065-2069.

[4]Kim YS, Paik SK, Cho YS, et al. Expression of P2X3receptor in the trigeminal sensory nuclei of the rat[J]. J Comp Neurol, 2008, 506(4):627-639.

[5]Hautaniemi T, Petrenko N, Skorinkin A, et al. The inhibitory action of the antimigraine nonsteroidal anti-inflammatory drug naproxen on P2X3 receptor-mediated responses in rat trigeminal neurons[J]. Neuroscience, 2012, 209:32-38.

[6]Maniyar FH, Sprenger T, Monteith T, et al. Brain activations in the premonitory phase of nitroglycerin-triggered migraine attacks[J]. Brain, 2014, 137(Pt 1):232-241.

[7]张慧，李冬霞，栗志勇，等. 芎芷石膏汤对硝酸甘油致偏头痛大鼠血浆NO、NOS、CGRP及脑中5-HT、 5-HIAA含量的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2014, 20(17):175-180.

[8]李涛，范吉平，曹克刚，等. 正天丸对多巴胺、硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠模型脑干神经递质影响[J]. 中华中医药杂志, 2014, 29(2):444-446.

[9]Romero-Reyes M, Akerman S. Update on animal models of migraine[J]. Curr Pain Headache Rep, 2014, 18(11):462.

[10]王先红，田苗苗，潘晴晴，等. 丘脑前核在三叉神经电刺激减轻癫痫发作和海马神经元损伤中的作用[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(12):2249-2253.

[11]王海华，姜玉新，王静，等. 心包腔注入炎性渗出液诱导大鼠三叉神经脊束核神经元c-Fos表达[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(11):1921-1928.

[12]Wirkner K, Sperlagh B, Illes P. P2X3 receptor involvement in pain states[J]. Mol Neurobiol, 2007, 36(2):165-183.

[13]Staikopoulos V, Sessle BJ, Furness JB, et al. Localization of P2X2 and P2X3 receptors in rat trigeminal ganglion neurons[J]. Neuroscience, 2007, 144(1):208-216.

[14]Chiang CY, Zhang S, Xie YF, et al. Endogenous ATP involvement in mustard-oil-induced central sensitization in trigeminal subnucleus caudalis (medullary dorsal horn)[J]. J Neurophysiol, 2005, 94(3):1751-1760.

[15]Hullugundi SK, Ferrari MD, van den Maagdenberg AM, et al. The mechanism of functional up-regulation of P2X3 receptors of trigeminal sensory neurons in a genetic mouse model of familial hemiplegic migraine type 1 (FHM-1)[J]. PLoS One, 2013, 8(4):e60677.

[16]刘斌，王彩霞，符艳松. 头痛宁胶囊对偏头痛模型大鼠三叉神经节P2X3 mRNA表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(19):188-190.

[17]Burnstock G. Physiopathological roles of P2X receptors in the central nervous system[J]. Curr Med Chem, 2015, 22(7):819-844.

[18]李涛, 范吉平, 曹克刚. 正天丸组方配伍及功效特点解析[J]. 中医药导报, 2013, 19(6):65-66.

[19]王勇，袁灿兴，商洪才，等. 正天丸治疗偏头痛随机对照双盲双模拟多中心临床研究[J]. 中成药, 2012, 34(5):791-794.

[20]刘慧兰，曹克刚，高永红，等. 正天丸对偏头痛大鼠的预防作用及对神经递质的影响研究[J]. 北京中医药大学学报, 2008, 31(11):745-747.

(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Effect of Zhengtian pills on P2X3receptor expression in trigeminal gan-glion of migraine rats

BAI Fang-hui1, LI Hui2, REN Zhi-jun1, DIAO Jian-xin1, QIU Ai-zhu3, CHEN Bao-tian1

(1Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;2Department of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou Red Cross Hospital Affiliated to School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510220, China;3Hunan Traditional Chinese Medical College, Zhuzhou 412000, China. E-mail: gy33mail@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of Zhengtian pills on P2X3 receptor expression in trigeminal ganglion (TG) of migraine rat. METHODS: Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group, migraine group, Zhengtian pills (ZTP) group and A-317491 group. After given corresponding drugs for 7 d, migraine rat model was established by subcutaneously injection of nitroglycerin (10 mg/kg), while the control rats were injected with saline. The beha-vioral manifestations of the rats were observed. The expression of P2X3 receptor in rat TG was detected by the methods of immunofluorescence, Western blot and rea-time PCR. RESULTS: About 5 min after subcutaneousl injection, the behavioral manifestations such as scratching head and climbing cage were observed. The behavioral manifestations were observed within the first 30 min in control group, but the erythroid ears did not appear. After 2 h of molding, the behavioral manifestations disappeared in ZTP group and A-317491 group, while those in migraine group lasted for 3 h. Immunofluorescence results showed that the expression of P2X3 receptor in TG was positive in each group. The expression level in migraine group was significantly higher than that in other groups. The P2X3 receptor protein and mRNA levels in the TG of migraine group were higher than those in control group (P<0.01), while those in ZTP group were lower than those in migraine group (P<0.01). No difference of the P2X3receptor expression between ZTP group and A-317491 group was observed. CONCLUSION: Zhengtian pills may effectively alleviate migraine by inhibiting the expression of P2X3receptor in TG.

[KEY WORDS]Zhengtian pills; Trigeminal ganglion; P2X3receptor; Migraine

[文章编号]1000- 4718(2016)05- 0923- 05

[收稿日期]2016- 01- 28[修回日期] 2016- 03- 20

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81202687)；广东省科技计划(No. 2012B061700018)；广东省中医药管理局科研课题(No. 20141218)

通讯作者△Tel: 020-61641672; E-mail: gy33mail@126.com

[中图分类号]R743.9; R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.026

杂志网址： http://www.cjpp.net