CRs、MMPs、VEGF在胰腺癌肿瘤相关成纤维细胞中的表达及其意义

冯兰云 陈联誉 曲超 王鹏 陈顥 林钧华 陈震 孟志强 刘鲁明

作者单位：200232 上海 复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科；复旦大学上海医学院肿瘤学系

基础研究

CRs、MMPs、VEGF在胰腺癌肿瘤相关成纤维细胞中的表达及其意义

冯兰云 陈联誉 曲超 王鹏 陈顥 林钧华 陈震 孟志强 刘鲁明

作者单位：200232 上海 复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科；复旦大学上海医学院肿瘤学系

目的 探讨趋化因子受体（chemokine receptors，CRs）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达与胰腺癌肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）生物学行为的关系。方法 用原代培养的方法建立胰腺癌CAFs和正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs）。用Real-time PCR方法检测CRs（CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7）、MMPs（MMP1、MMP2、MMP7、MMP9）和VEGFmRNA的表达。结果 成功建立胰腺癌CAFs和正常胰腺NFs。在CAFs和NFs中，趋化因子受体CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7 mRNA的表达均存在差异，CAFs表达量高于NFs。其中CXCR2、CXCR4 mRNA在两株细胞中的表达差异具有统计学意义（P=0.010，P=0.049）。MMPs和VEGF mRNA的表达同样存在差异，CAFs中MMP7和VEGF mRNA表达明显高于NFs，差异具有统计学意义（P=0.017，P=0.049）；CAFs中MMP9 mRNA的表达明显低于NFs，差异具有统计学意义（P=0.012）。结论 在胰腺癌CAFs中CRs、MMPs和VEGFmRNA的表达有差异，可能与其促侵袭转移能力存在一定的相关性。

胰腺肿瘤；肿瘤相关成纤维细胞；正常成纤维细胞；趋化因子受体；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子

胰腺癌是临床上常见的恶性肿瘤，早期无明显症状，确诊时仅20%的患者有手术治疗机会，加之胰腺癌恶性程度高，对放化疗不敏感，治疗效果较差，严重威胁人类生命健康［1，2］。因此，探究胰腺癌的发病机制，特别是肿瘤微环境与胰腺癌的关系意义深远。目前在乳腺癌、肺癌、结直肠癌中已有研究显示肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）具有促侵袭转移作用，并与多种恶性肿瘤预后相关。但在胰腺癌中的研究尚在起步阶段。我们前期研究发现趋化因子CXCLs在胰腺癌相关的正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs）和胰腺癌CAFs中的表达存在明显差异，且可提高胰腺癌Capan1细胞迁移及侵袭能力［3，4］。由此根据趋化因子-趋化因子受体生物学轴的相互作用设想匹配的CRs在胰腺癌CAFs和胰腺NFs中可能也存在差异性表达。现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 胰腺癌CAFs和胰腺NFs由复旦大学附属肿瘤医院用胶原酶消化法和组织块培养法从胰腺组织和癌旁正常组织中分离得到，具体方法如Walter等［5］所述。细胞接种于含10%胎牛血清（FBS）DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，1个月后首次传代，之后常规换液、传代，取10代以内对数生长期的原代成纤维细胞进行实验。采用免疫荧光法对原代细胞进行鉴定。

1.1.2 细胞培养相关试剂 RPMI 1640（500 mL）、DMEM培养基（500 mL）、FBS（100 mL）、磷酸盐缓冲液（PBS，1000mL）、0.25%胰蛋白酶（100mL）、丙酮酸钠（100mL）、HEPES（100mL）均购自美国Gibco公司；1%青链霉素双抗（100mL）购自美国Hyclone公司。

1.1.3 免疫组化相关试剂 抗广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin，CK）抗体（1 mg）购自广州Ascend Biotechnology公司；抗E-cadherin（500μL）、抗Vimentin（100 μg）、抗α-SMA（100μL）购自美国Epitomics公司；苏木素（100mL）、伊红（100mL）、PBS（500mL）购自福建迈新公司生物技术开发公司。

1.1.4 RT-PCR相关试剂 Trizol（100mL）、递转录试剂盒（50次量）购自Takara公司；SYBR Green PCR Master Mix（1 mL）购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 CAFs和NFs培养 按照美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）推荐的方法进行细胞培养。使用0.25%胰蛋白酶进行消化，按1∶3比例传代。

1.2.2 CAFs和NFs免疫荧光鉴定 细胞爬片，4%多聚甲醛固定10min（如固定细胞器选择预冷的70%甲醛+30%丙酮）。PBS漂洗5min，0.3%Triton穿孔15min，PBS漂洗3次，每次5 min，1%BSA封闭30 min，加入1%BSA稀释的一抗，于4°C过夜。PBS漂洗3次，每次5 min，加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1.5 h（Dylight1∶50）。PBS漂洗3次，每次5min，5μg/mL DAPI染色2min。抗淬灭封片剂封片。

1.2.3 组织细胞总RNA提取、cDNA合成和Realtime PCR 两种细胞株均用Trizol法提取总RNA，分光光度计检测抽提质量和浓度，反转录合成cDNA，采用Real-time PCR方法检测mRNA表达。从GenBank中检索出CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7的基因序列号和相应序列。采用Premier 5.0引物设计软件设计引物，并通过BLAST排除产物同源序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。实时RT-PCR结果以阈循环（cycle threshold，Ct）值表示。每个样本重复3个复孔，取3个复孔的平均Ct值作为终值，用2－△△Ct计算mRNA相对表达量，△Ct＝Ct目标基因-CtGAPDH。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0软件对数据进行分析处理，计数资料用均数±标准差（±s）表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析。方差齐时，采用LSD法；方差不齐时，采用Games-Howen法。等级资料采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 建立胰腺NFs和胰腺癌CAFs细胞

经过原代培养建立两株相应的胰腺NFs和胰腺癌CAFs，并选取人CK、E-cadherin，间质标记物Vimentin及CAFs特异性标记物α-SMA，通过荧光免疫（ICC）法对其进行鉴定。形态学上两种成纤维细胞都呈长梭形，细胞核不规则。与CAFs相比，NFs外观较短小。见图1。

表1 引物序列

图1 胰腺NFs及胰腺癌CAFs（×40）

ICC标记结果显示，胰腺NFs和胰腺癌CAFs都不表达上皮细胞标志物CK及E-cadherin，但都表达间质标志物Vimentin，CAFs还高表达其特异指标α-SMA（见图2）。提示成功建立人胰腺NFs及胰腺癌CAFs。

2.2 在胰腺NFs和胰腺癌CAFs中CRsm RNA的表达在NFs和CAFs中，趋化因子受体CXCR1、CXCR2、 CXCR4、CXCR7 mRNA的表达均存在差异，表现为CAFs表达量高于NFs。其中CXCR2、CXCR4 mRNA在两株细胞中的表达差异有统计学意义（P=0.010，P=0.049）。而CXCR1、CXCR7 mRNA在两株细胞中表达差异无统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 胰腺NFs及胰腺癌CAFs ICC鉴定结果（×100）

图3 胰腺NFs及胰腺癌CAFs中CRs m RNA的表达

2.3 MMPs和VEGFmRNA在胰腺NFs和胰腺癌CAFs中的表达

在NFs和CAFs中，MMPs和VEGFmRNA的表达均存在差异。CAFs中MMP7和VEGFmRNA的表达明显高于NFs，差异具有统计学意义（P=0.017，P=0.049）；CAFs中MMP9 mRNA的表达明显低于NFs，差异具有统计学意义（P=0.012）；而MMP1、MMP2 mRNA虽有表达差异，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 MMPs和VEGF mRNA在胰腺NFs及胰腺癌CAFs中的表达

3 讨论

肿瘤微环境概念（血管生成理论）于1971年由Folkman提出。研究者在进一步深入探索中发现肿瘤间质（血管、免疫细胞、趋化因子、细胞外基质等）在肿瘤的发生、发展、转移中扮演重要的角色［5～8］。而针对胰腺癌肿瘤微环境制定新治疗方案，取得了一定成效，提示肿瘤微环境在胰腺癌形成过程中发挥了重要作用［9，10］。

CAFs是一类特殊的与肿瘤相关的成纤维细胞，是肿瘤微环境重要成员之一。它的来源具有争议性，主要包括三大类：局部的成纤维细胞、骨髓间充质来源的前体细胞和转分化的表皮（内皮）细胞，此外还有一种来源为肿瘤细胞［11～13］。CAFs的作用主要是分泌生长因子、细胞因子和蛋白酶、调节肿瘤代谢，肿瘤细胞外基质重建、为转移微环境做准备、与肿瘤耐药及复发等有关。它是多种恶性肿瘤（如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌）间质中最引人关注的细胞类型［14，15］。而CAFs的表达也被发现与多种恶性肿瘤的预后相关［16～19］。

大量证据表明胰腺癌细胞与其周围的CAFs存在密切的相互作用［20，21］。而趋化因子及受体、MMPs作为肿瘤微环境的重要一员，与两者亦密切联系［22，23］。我们前期研究发现趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL8在胰腺癌相关的NFs和CAFs中的表达存在明显差异，CAFs明显高于NFs，且这些趋化因子可以提高胰腺癌Capan1细胞迁移及侵袭能力［3，4］。由此，根据趋化因子-趋化因子受体生物学轴相互作用原理，设想和这些趋化因子相对应的受体在NFs和CAFs中可能也存在差异性表达，从而造成NFs和CAFs在生物学上促进肿瘤迁移和侵袭能力的差别。本研究结果显示，转移相关的趋化因子受体CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7mRNA在胰腺癌CAFs中的表达量均高于胰腺NFs，其中CXCR2、CXCR4在两株细胞中的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。大量研究提示CXCR2、CXCR4在促进恶性肿瘤增殖、侵袭及远处器官转移中发挥举足轻重的作用。我们前期及本研究中，CAFs培养液CXCL1、CXCL2、CXCL8的表达量明显高于NFs，由此推断，CAFs在生物学行为上表现出的促肿瘤侵袭转移能力可能与CRs表达增加、促进后续的受体-配体生物学轴作用相关。

同时，本研究还发现，MMPs和VEGF mRNA在胰腺NFs和胰腺癌CAFs中的表达同样存在差异。MMPs在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是浸润转移过程中最主要的蛋白水解酶。而MMP1、MMP2、MMP7、MMP9则是肿瘤血管生成的主要角色，MMPs通过降解或清除细胞外Ⅳ、Ⅷ、X型胶原、串珠素等上调VEGF、bFGF等重要因子的生物活性或增加肿瘤抑素、内皮抑素、血管抑素等表达，以保持血管生成的平衡。本研究胰腺癌CAFs中MMP7 mRNA和VEGF mRNA的表达明显高于胰腺NFs（P＜0.05），MMP9 mRNA的表达明显低于胰腺NFs（P＜0.05），MMP1、MMP2 mRNA虽有表达，但差异无统计学意义（P＞0.05）。提示胰腺NFs、胰腺癌CAFs中MMPs和VEGFmRNA的表达无明显规律性，与胰腺癌CAF s促迁移侵袭能力的相关性尚不明确，还有待进一步深入研究。

综上所述，CAFs是抗胰腺癌治疗中的一个重要靶点，可能通过调节趋化因子及其受体、MMPs和VEGF等重要的内环境因子而对胰腺癌的整个微环境产生影响。针对该靶点的药物可能会为胰腺癌的治疗开辟新的途径。

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［2015-08-15 收稿］［2016-01-10修回］［编辑 江德吉］

Expression of chemokine receptors，MMPs，and VEGF in pancreatic cancer fibroblast cell lines

Feng Lanyun，Chen Lianyu，Qu Chao，Wang Peng，Chen Hao，Lin Junhua，Chen Zhen，Meng Zhiqiang，Liu Luming（Department of Integrative Oncology，Fudan University Shanghai Cancer Center；Department of Oncology，ShanghaiMedical College，Fudan University，Shanghai 200032，P.R.China）

Liu Luming.E-mail:llm1010@163.com

Objective To establish cancer associated fibroblast（CAF）lines and normal fibroblast（NF）lines and use them to investigate expression of chemokine receptors，MMPs and VEGF and thereby understand the biological behavior of CAFs in pancreatic cancer.M ethods Primary cultures of CAFs and NFs were established，and mRNA levels of chemokine receptors，MMPs and VEGF were measured using RT-PCR.Results Expression ofmRNAs encoding the chemokine receptors CXCR1，CXCR2，CXCR4，and CXCR7 was higher in CAFs than in NFs.This differencewas statistically significant in the case of CXCR2（P=0.010）and CXCR4（P=0.049）.Similarly，MMP7 mRNA was expressed at significantly higher levels in CAFs（P=0.017），as was VEGF（P=0.049）. Conversely，MMP9 mRNA levels were significantly higher in NFs（P=0.012）.Conclusion Differential expression of chemokine receptors，MMPs and VEGF in CAFs may help explain their aggressive behavior in pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms；Cancer associated fibroblast；Normal fibroblast；Chemokine receptors；Matrix metalloproteinases；Vascular endothelial growth factor

R735.9

A

1674-5671（2016）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.04.03

国家自然科学基金青年基金资助项目（81102004）；上海市卫生局中医药基金资助项目（2010QJ032A）

刘鲁明。E-mail：llm1010@163.com