经导管射频消融去肾交感神经术对犬肾脏水通道蛋白的影响*

任鹏程， 刘 畅， 邱先迪， 陈伟杰， 殷跃辉

(重庆医科大学附属第二医院心内科， 重庆 400010)

经导管射频消融去肾交感神经术对犬肾脏水通道蛋白的影响*

任鹏程， 刘 畅， 邱先迪， 陈伟杰， 殷跃辉△

(重庆医科大学附属第二医院心内科， 重庆 400010)

目的： 研究经导管射频消融去肾交感神经术(renal denervation，RDN)对肾脏水通道蛋白(aquapo-rins,AQP)的影响。方法: 选用昆明犬12只，随机分为对照组和消融组，每组6只。消融组采用射频导管消融双侧肾动脉，对照组仅将射频导管送达肾动脉但不消融。术后1月，检测2组犬肾脏去甲肾上腺素浓度、肾脏皮质和髓质AQP水平,以及血压的变化。结果: 术后1月，消融组肾脏去甲肾上腺素浓度明显低于对照组(P<0.01)，消融组肾脏皮质和髓质AQP1～3的表达均低于对照组。相比术前，术后收缩压和舒张压也出现明显下降(P<0.05)。结论: RDN能降低犬肾脏交感神经活性,并抑制肾脏AQP的表达，这或许是RDN降血压的机制之一。

肾交感神经； 射频导管消融； 去甲肾上腺素； 水通道蛋白； 犬

目前尽管高血压的确切发病机制尚不清楚，但交感神经系统的激活、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的激活和肾性水钠潴留等机制参与高血压的发病被大家所认可。经导管射频消融去肾交感神经术(renal denervation，RDN)通过消融肾动脉周围的肾脏传入和传出神经，能有效降低全身交感神经系统活性和RAS活性，在治疗难治性高血压和改善心功能上取得一定效果[1-2]。但关于RDN对机体水钠潴留影响的实验研究却未见报道。作为肾脏重吸收和调节体内水平衡的通道，水通道蛋白(aquaporins，AQP)表达的改变直接影响肾脏对水的重吸收变化，实验证明，水通道蛋白表达异常与高血压、心力衰竭、慢性肾功能不全等多种水平衡紊乱疾病相关[3-5]。本实验拟初步探讨RDN对肾脏水通道蛋白的影响，为探索RDN的降压机制提供新的实验依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物

采用中国成年昆明犬12只，体重30～35 kg，收缩压140 mmHg以上。随机抽取6只进入消融组，行肾动脉射频消融术；另外6只作为对照组，仅将射频导管送达肾动脉处而不消融。所有实验均通过重庆医科大学动物实验伦理委员会批准，并严格执行国家卫计委关于实验动物的饲养原则。

2 实验方法

2.2 随访评价及标本获取 术后定期观察犬一般情况。术后1月，通过股动脉入路测量血压,并行双侧肾动脉造影。随访完毕，大剂量麻醉剂处死实验犬，获取肾脏并立即处理，一部分肾组织分装于液氮中，另一部分用4%多聚甲醛固定备用。

2.3 高效液相色谱法检测去甲肾上腺素 将冰冻的肾脏组织块用5%的高氯酸和1.5 mol/L的醋酸钠匀浆，然后在4 ℃、10 000×g的条件下离心10 min。采用高效液相色谱(HTTACHI)法检测肾脏组织去甲肾上腺素浓度。

2.4 Western blot实验 从冰冻肾脏上分别取皮质部分和髓质部分，然后按如下方法检测水通道蛋白。取100 mg相应组织于匀浆器中，加入裂解液和PMSF，在冰上匀浆10 min，然后4 ℃、12 000×g条件下离心10 min，并吸取上清液，以BCA法测定蛋白浓度，然后加入1/4体积的5×SDS缓冲液，以100 ℃加热10 min备用。检测蛋白，肾脏皮质蛋白每孔泳道上样120 μg，肾脏髓质蛋白每孔泳道上样80 μg，然后用5%浓缩胶和10%分离胶行SDS-PAGE。以250 mA恒流条件将蛋白转移至二氟化聚乙烯(polyvinylidence difluoride，PVDF)膜上。用5%的脱脂奶粉封闭1 h，然后I抗(兔抗AQP1、AQP2和AQP3多克隆抗体，Santa Cruz)孵育，4 ℃过夜。用PBST洗涤 10 min ×3次。II抗孵育，37 ℃、1 h。再用PBST洗涤10 min×3次。然后加入Western blot实验荧光显影剂显影，并用Quantity One凝胶系统扫描图像并分析。

2.5 免疫组化实验 按照免疫组化检测试剂盒和浓缩型DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥)说明书方法，肾脏组织石蜡切片脱蜡，洗涤，以3% H2O2室温下孵育10 min，然后加入枸橼酸钠溶液，采用微波修复10 min，用血清室温孵育30 min，加I 抗(兔抗AQP1和AQP2多克隆抗体，Santa Cruz)4 ℃孵育过夜，然后加入II 抗37 ℃孵育45 min，以亲和素-生物素复合物室温孵育60 min，以DAB 显色，苏木素复染，遂脱水，透明，封片，光学显微镜下观察。

3 统计学处理

应用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析处理。所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示。若数据满足方差齐性，组间数据采用独立样本t检验，组内实验前后数据采用配对样本t检验。若数据不满足方差齐性，采用Satterthwaite近似t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 肾脏组织内去甲肾上腺素水平的变化

看着老婆那乱改古训蛮不讲理的样子，我只得说，我不是当官了吗？堂堂的县农业局副局长，副科级，月薪2358块。

RDN术后1月，消融组犬肾脏组织去甲肾上腺素水平明显低于对照组(P<0.01)。

2 肾脏组织内AQP1、AQP2和AQP3 表达的变化

2.1 Western blot实验结果 RDN术后1月，消融组肾皮质和髓质AQP1的表达均明显低于对照组(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The effect of RDN on the expression of AQP1 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

图1 Western blot 实验检测AQP1的表达

RDN术后1月，消融组肾髓质AQP2表达低于对照组(P<0.01)，而肾皮质AQP2的表达两组间差异无统计学显著性，见图2。

Figure 2.The effect of RDN on the expression of AQP2 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

图2 Western blot 实验检测AQP2的表达

消融组肾髓质AQP3的表达低于对照组(P<0.05)，而肾皮质AQP3两组间差异无统计学显著性，见图3。

Figure 3.The effect of RDN on the expression of AQP3 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol.

图3 Western blot 实验检测AQP3的表达

2.2 免疫组化结果 AQP1主要分布在肾皮质的近端小管和髓质的细段，在皮质近端小管，消融组AQP1的表达低于对照组(P<0.05)；在髓质细段，消融组AQP1的表达也低于对照组(P<0.01)，见图4。

Figure 4.AQP1 immunoreactivity in the renal proximal tubule (A) and the thin limb of Henle’s loop (B) in control group and RDN group (×1 000).

图4 免疫组化检测对照组和实验组肾脏皮质和髓质AQP1的表达

AQP2主要分布于肾皮质和髓质的集合管管腔侧细胞膜，在髓质集合管，消融组AQP2的表达明显低于对照组(P<0.01)；而在皮质集合管，消融组AQP2的表达与对照组相比无统计学差异，见图5。

Figure 5.AQP2 immunoreactivity in the cortical collecting duct (A) and the medullary collecting duct (B) in control group and RDN group (×1 000).

图5 免疫组化检测对照组和实验肾脏皮质和髓质AQP2的表达

3 血压的变化及术后血管评价

射频消融后1月，相比基线血压值，消融犬收缩压和舒张压均出现明显下降(P<0.05)。在RDN术前、术后即刻和术后4周，行肾动脉造影未见动脉瘤或血管狭窄等手术并发症，见图6。

Figure 6.The results of angiography before (A), immediately after (B), and one month after (C) RDN.

图6 实验组射频消融术前、术后即刻和术后1月肾动脉造影观察

讨 论

在本实验中，是否有效损毁肾脏交感神经是RDN发挥作用的基础，而且肾脏组织内去甲肾上腺素浓度是评价肾脏交感神经活性变化的经典指标[6]。Krum等[7]对小猪行RDN，术后肾脏组织去甲肾上腺素下降幅度超过85%，其对肾脏交感神经抑制程度与切断肾动脉再缝合手术对肾脏交感活性的作用相当。本研究通过高效液相色谱法对肾组织内去甲肾上腺素浓度进行了检测，结果表明，消融组犬肾组织去甲肾上腺素水平明显低于对照组。

本实验首次观察到射频消融肾交感神经后肾脏AQP表达下调，表明肾交感神经的激活对肾脏AQP的表达有促进作用。关于肾交感神经促进肾脏AQP表达的具体机制目前尚不清楚，但本实验检测到RDN术后肾组织内去甲肾上腺素水平明显下降，且Sonalker等[8]证实去甲肾上腺素能直接促进肾小管AQP的表达，故可以推测肾交感神经激活后，通过调节去甲肾上腺素的释放，发挥其促进肾脏AQP表达的作用。由于肾交感神经还可促进RAS的激活，使血管紧张素II(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)表达上调，而实验证明Ang II也具有增强肾脏AQP表达的作用[9-10]。我们前期的实验也证实了RDN术后血浆Ang II活性明显下降[11]，所以肾交感神经激活后，通过RAS间接促进Ang II的合成，或许也是肾脏AQP表达增加的机制之一。

肾交感神经促进肾脏AQP表达增加，可解释高血压、心衰等高交感活性疾病中所观察到的体液储留和AQP表达增加[3-4]。肾交感神经激活，通过增强肾小管和集合管AQP对水的重吸收，参与高血压和心衰等疾病的发生发展，此研究结果为RDN在高血压、心力衰竭、慢性肾功能不全等更多水储留疾病的应用提供了依据。RDN降低肾脏交感活性，不但使肾脏AQP表达下调，同时也伴随血压的下降，表明AQP表达下调也许与RDN的降压机制有关。

本实验尚发现，RDN使肾髓质AQP1、AQP2和AQP3表达下降，而肾皮质仅AQP1表达下降，表明肾髓质水通道蛋白对肾交感神经的调节更为敏感。这一结果与Lee等[12]采用苯酚损毁大鼠肾交感神经时发现的结果基本一致，这或许与各水通道蛋白亚型在肾脏皮质、髓质不同结构的差异性表达及肾脏皮、髓质不同结构间的功能差异有关[13]，但其具体机制有待进一步研究。

由于本实验选择的动物为大型昆明犬，其实验结果并不能完全代表人体情况。同时本实验只在RDN术后4周取标本检测指标，未能观察更长期的实验结果。在今后的实验中将延长实验观察期，为RDN对水通道蛋白的长期调节及降压机制提供实验依据。

综上所述，肾交感神经激活通过调节去甲肾上腺素和AngII的释放，对肾脏水通道蛋白的表达起促进作用。RDN能降低犬肾脏交感神经活性,并抑制肾脏水通道蛋白的表达，这或许是RDN降血压的机制之一。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

清除老年痴呆症小鼠小胶质细胞可以防止神经元丢失但并不调节β-淀粉样蛋白的病理改变

除了β-淀粉样蛋白斑和tau蛋白过度磷酸化引起的神经元纤维缠结外，神经炎症被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)的另一个重要病理特征。炎症在阿尔茨海默氏病的特征性表现为反应性星形胶质细胞和活化的小胶质细胞在淀粉样蛋白斑周围聚集，提示活化的小胶质细胞在疾病的发病机制中发挥了作用。在健康成年小鼠，小胶质细胞的生存依赖于集落刺激因子1受体(colony-stimulating factor 1 receptor, CSF1R)的信号，这种受体的调节使得中枢神经系统的通过药理学抑制作用可以快速清除几乎所有的小胶质细胞。为了确定是否阿尔茨海默病大脑中慢性小胶质细胞激活也依赖于CSF1R信号，如果是，那么这些细胞是如何在疾病的发病机制中发挥作用的，Spangenberg等选择了10月龄的5xfAD小鼠，给予选择性CSF1R抑制剂处理1个月，结果显示80%的小胶质细胞得以清除。慢性小胶质细胞清除并不改变β-淀粉样蛋白的水平或斑块沉积，但它确实降低了5xfAD小鼠树突的损失和防止了神经元的丢失，同时在整体上减轻了神经炎症。重要的是，行为学测试表明小鼠的记忆功能得到改善。总的来说，这些研究结果表明，清除小胶质细胞在防止神经元的丢失以及改善5xfAD小鼠记忆障碍方面发挥了作用，但它并不调节或改变β-淀粉样蛋白的病变。

Brain, 2016, 139(Pt 4):1265-1281(范冲竹)

Effect of renal denervation by radiofrequency catheter ablation on expression of aquaporins in dog kidneys

REN Peng-cheng, LIU Chang, QIU Xian-di, CHEN Wei-jie, YIN Yue-hui

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:yinyh63@163.com)

AIM: To investigate the effect of renal denervation (RDN) by radiofrequency catheter ablation on the expression of aquaporins (AQP) in dog kidneys.METHODS: Adult Chinese Kunming dogs (n=12) were randomly divided into RDN group and control group (6 for each group). The dogs in RDN group underwent bilateral RDN using radiofrequency catheter ablation, and radiofrequency catheter was positioned in bilateral renal artery without ablation in control group. The levels of norepinephrine (NE) and AQP1～3 in the renal tissues were detected 1 month after RDN, and blood pressure (BP) measurements were performed at baseline and 1 month after RDN.RESULTS: The level of NE in RDN group was significantly lower than that in control group (P<0.01). The expression of AQP1～3 in the renal cortex and medulla was lower in RDN group than that in control group. RDN also caused a substantial BP reduction (P<0.05). CONCLUSION: RDN substantially decreases the tissue levels of NE and AQP in dog kidneys, and also decreases BP significantly, which might be involved in the mechanism of BP reduction by RDN. Renal sympathetic nerve plays an excitatory role in the regulation of AQP in the kidney.

Renal sympathetic nerve; Radiofrequency catheter ablation; Norepinephrine; Aquaporins; Dogs

1000- 4718(2016)08- 1430- 05

2016- 03- 07

2016- 05- 11

重庆市科委自然科学基金资助项目(No. cstc2013jcyjA10066)

R454.1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.015

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 023-63693065； E-mail: yinyh63@163.com