川黄合剂对TNF-α诱导的人腹膜间皮细胞IL-6和IL-8表达的影响

朱桂松，傅元冬，陈畅泉

(江苏省南京市中医院，江苏 南京 210001)



川黄合剂对TNF-α诱导的人腹膜间皮细胞IL-6和IL-8表达的影响

朱桂松，傅元冬，陈畅泉

(江苏省南京市中医院，江苏 南京 210001)

[摘要]目的探讨川黄合剂对TNF-α诱导的体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMCs)增殖及白细胞介素-6(IL-6)和IL-8表达的影响。方法体外培养HPMCs，用含1%胎牛血清的RPMI-1640培养液同步24 h后，分为空白对照组、TNF-α诱导组(1 μg/L)和低、中、高剂量川黄合剂干预组(n=3)。采用MTT法和流式细胞术检测各组细胞的增殖情况；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-6和IL-8蛋白含量，细胞沉淀用BCA蛋白检测方法测定细胞蛋白质含量，用以校正ELISA结果。结果干预48 h后，3种浓度川黄合剂干预组的OD值、PI值均显著高于TNF-α诱导组(P均<0.05)，且IL-6和IL-8蛋白表达水平均明显低于TNF-α诱导组 (P均<0.05)。结论川黄合剂能增强炎症状态下HPMCs活性，并降低炎症因子IL-6和IL-8的表达。

[关键词]川黄合剂；生大黄；川芎；白细胞介素-6；白细胞介素-8；急性腹膜炎

急性腹膜炎是临床常见急腹症，治疗不及时易引发全身炎症反应综合征(SIRS)/脓毒血症(SEPSIS)并导致多器官功能障碍综合征(MODS)或多脏器衰竭(MOF)，病死率极高[1]。多种炎症因子参与腹膜炎的病理生理过程，其中最主要的促炎因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和某些白细胞介素家族成员如白细胞介素-6(IL-6)、IL-8，这些炎症递质在体内组成复杂庞大的细胞网络，在炎症反应时形成“瀑布式”释放的级联反应，诱导SIRS及MODS[2-3]。因此，治疗腹膜炎的核心就是早期抑制炎症因子的表达，阻断失控的炎症反应及细胞损害。根据中医辨证论治原则，我院自拟川黄合剂(大黄和川芎配伍)治疗腹膜炎取得了很好的临床疗效。本实验旨在通过观察川黄合剂对体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMCs)在急性炎症状态下炎症因子的干预作用，探讨川黄合剂的抗炎效应以及对HPMCs的保护作用，为临床应用川黄合剂提供实验依据。

1实验资料

1.1材料生大黄颗粒剂(1包相当于生药10 g)，川芎(1包相当于生药6 g)，由江阴天江药业有限公司提供；磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FCS)、RPMI-1640粉剂等(Gibco公司)；胰蛋白酶(Promega公司)；IL-6、IL-8和ELISA试剂盒(ADL公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒(南京凯基生物科技公司)；抗细胞角蛋白抗体、抗细胞波形蛋白抗体、第Ⅷ因子抗体和抗白细胞CD45抗体(北京中山生物技术有限公司)；NU-2500E 二氧化碳培养箱(Nuaire)；全自动酶标仪(Biobank)。

1.2方法

1.2.1HPMCs的培养与鉴定取南京市中医院普外科及肛肠科30例(排除腹膜炎)择期腹部手术患者捐献的大网膜组织，按标准方法原代培养HPMCs，按1∶3传代，第3代细胞用于实验。倒置相差显微镜观察HPMCs呈多边形，似铺路鹅卵石样外观；免疫组化鉴定抗细胞角蛋白抗体和抗波形蛋白抗体染色阳性、抗第Ⅷ因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性。

1.2.2实验步骤和分组生大黄颗粒、川芎颗粒各1包紫外线消毒，分别用灭菌注射用水60 mL溶解，备用。HPMCs用含1%FCS的RPMI-1640培养液同步24 h后分为5组(每组设3个样本)，即空白对照组、TNF-α诱导组(1 μg/L)和TNF-α诱导加低、中、高剂量川黄合剂(生大黄终浓度分别为10，30，60 mg/L；川芎浓度分别为6，18，36 mg/L)干预组。各组完全培养液均为含有15%FCS的RPMI-1640培养液。细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱培养48 h。

1.2.3细胞毒性实验川黄合剂中生大黄与川芎配伍比率选为10∶6，为了排除本实验中所选择的生大黄与川芎浓度对HPMCs本身产生毒性作用，对实验浓度的川黄合剂进行了细胞毒性的观察。步骤如下：用完全培养液将HPMCs以105个/mL浓度接种于24孔培养板中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h；然后再每孔加入生大黄终浓度分别为10，30，60 mg/L和川芎浓度分别为6，18，36 mg/L的川黄合剂，继续培养24 h，显微镜下观察细胞形态。

1.2.4活细胞数测定分组干预48 h后，吸弃旧培养液，加入MTT(5 mg/mL)继续培养3 h，加DMSO振荡混匀，置于自动酶标仪上，自动酶标仪以490 nm波长测定各孔的吸光度(OD)值，以OD 值表示HPMCs活性。

1.2.5细胞增殖情况检测取干预48 h后的细胞，胰蛋白酶消化，每孔加入0.5 mL完全培养液重悬细胞；碘化丙啶室温避光染色20 min，用流式细胞仪检测细胞周期情况，Cell Quest软件分析，用细胞分裂增殖指数(proliferation index,PI)表示相对增殖活力。计算公式为：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2M) ×100%。

1.2.6细胞上清液中IL-6和IL-8蛋白含量检测离心取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL-6和IL-8蛋白含量。用0.1 mol/L 氢氧化钠溶解细胞沉淀，BCA蛋白检测试剂盒测定细胞沉淀中蛋白质浓度，用相应蛋白质浓度结果校正检测结果。

2结果

2.1细胞毒性实验本实验所选剂量的川黄合剂无明显毒性作用，细胞形态良好。

2.2各组HPMCs活性空白对照组MTT OD值为0.89±0.06，TNF-α诱导组为0.48±0.04，低剂量川黄合剂组为0.59±0.03，中剂量川黄合剂组为0.64±0.05，高剂量川黄合剂组为0.69±0.06。TNF-α诱导组细胞MTT OD值明显低于空白对照组(P<0.05)；加用川黄合剂干预后， MTT OD值均显著高于TNF-α诱导组(P均<0.05)。

2.3各组细胞增殖情况空白对照组HPMCs PI值为19.47±2.05，TNF-α诱导组为10.70±1.61，低剂量川黄合剂组为14.94±1.69，中剂量川黄合剂组为15.16±1.82，高剂量川黄合剂组为16.63±2.12。TNF-α诱导组PI值明显低于空白对照组(P<0.05)；加用川黄合剂干预后，PI值均显著高于TNF-α诱导组(P均<0.05)。

2.4各组上清液中IL-6和IL-8蛋白含量TNF-α诱导组上清液中IL-6和IL-8含量均明显高于空白对照组(P均<0.05)；加用川黄合剂干预后，上清液中IL-6和IL-8含量均明显低于TNF-α诱导组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组上清液中IL-6和IL-8蛋白含量

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与TNF-α诱导组比较，P<0.05。

3讨论

急性腹膜炎可以是原发或继发起病，如消化道穿孔、胆管穿孔、腹腔内器官损伤破裂或血运障碍坏死、重症感染致肠道菌群移位等[4-5]。细菌和内毒素等抗原激活宿主单核巨噬细胞系统，后者释放多种细胞因子，引起促炎和抗炎反应失衡，持续不受控制的炎症反应即SIRS[2，6]。所以说，炎症因子在腹膜炎的病理生理过程中占主导地位。目前认为TNF-α是炎症反应的启动因子[7-8]，而HPMCs作为腹膜表面的主要细胞层参与了炎症反应过程[9]。近年来连续性肾脏替代治疗(CRRT)等抢救技术有较大发展，但腹膜炎引起的SEPSIS及MODS的病死率仍然居高不下，这就使得临床医生不断探索有效的联合治疗方法。

祖国医学注重整体观念，强调阴阳平衡，双向调节机体免疫及器官功能状态，在早期抑制炎症反应、防治MODS、降低临床病死率方面有积极意义[6]。在古代文献中有类似急性腹膜炎症候的记载，散见于“肠痈”“腹痛”“厥心痛”“厥逆”“结胸”“脾心痛”“肠结腹痛”“心腹痛”等的论述中。如《素问·至真要大论》记载：“厥阴之腹，少腹坚满，里急暴痛……厥心痛，汗发呕吐。”《伤寒论》记载“心下痛，按之石硬”、“从心下至少腹硬满而痛，不可近”。《景岳全书·始经篇》云：“厥逆之为病也，足暴青，胸若将裂，肠若将以刀切之，烦而不能食。”这些描述与急性腹膜炎的症状相似，提示在急性腹膜炎的某阶段，可参照其中的理法方药进行辨治。

急性腹膜炎中医辨证多为阳明证或少阳阳明合病，病位在腑，常表现出腹满拒按、便结或便闭等热结阴阳、腑实不通之证。根据中医“腑通以通为补，六腑以通为用”的原则，治疗以清热解毒、通里攻下为主，活血化瘀、理气开郁为辅。通腑攻下具有泄热、行瘀、通便的作用，可促进肠蠕动，改善腹腔及脏器的血液循环，促进炎症的局限和吸收，同时减少了内毒素异位，从而显著减轻肠源性内毒素血症造成的脏器损伤[10]。川黄合剂取大黄和川芎配伍，能“通里攻下、清瘀热、解热毒”，同时“气行则血行”。现代医学研究发现大黄有改善微循环、抑酶、抑菌、抑制巨噬细胞过度激活及中性粒细胞浸润，减少炎症细胞因子及自由基的释放等作用[11]。大黄还可抑制炎症因子表达；增加肠蠕动，减少肠道对葡萄糖、钠、水的吸收稀释和排泄细菌和毒素；保护肠道黏膜屏障，阻止肠道细菌易位和内毒素血症的发生；抑制肠道细菌生长，达到清理肠道的作用；肠外器官保护作用。川芎具有改善微循环的作用，并且可以提高其他药物的抗炎作用[12]。李继承等[13]研究发现中药川芎的主要药理成分川芎嗪具有明显的抗菌和促进巨噬细胞吞噬功能的作用。贾米山等[14]用川芎嗪治疗结核性腹膜炎，结果显示可使腹水渗出减少，促进腹水吸收，使肠粘连迅速缓解，明显控制患者结核中毒症状，缩短病程。

本研究结果显示，TNF-α能显著上调HPMCs IL-6和IL-8的表达，且抑制细胞活性，而川黄合剂能显著对抗TNF-α的上述作用，提示川黄合剂确有抑制炎症因子IL-6和IL-8表达、保护腹膜细胞的作用。

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Effect of Chuan-huang mixtures on TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions in human peritoneal mesothelial cells in vitro

ZHU Guisong, FU Yuandong, CHEN Changquan

(Nanjing Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210001,Jiangsu,China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of Chuan-huang mixtures on TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions and proliferation in human peritoneal mesothelial cells (HPMCs) in vitro. Methods Cell lines of HPMCs were subcultured and all experiments were performed using the cells at the third passage. After synchronization of cells growth with RPMI-1640 culture solution containing 1% fetal bovine serum, HPMCs were divided into blank control group, TNF-α-induced (1 μg/L) group and TNF-α-induced plus low-, medium-and high-dose Chuan-huang mixtures groups. The proliferation of HPMCs was measured by MTT and flow cytometry assay. Proteins of IL-6 and IL-8 in culture supernatants were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Cell protein concentration was measured by trace bicinchoninic acid (BCA) method to correct the ELISA assay results. Results After co-culturing by 48h, the proliferation of HPMCs in TNF-α-induced plus low-, medium-and high-dose Chuan-huang mixtures groups were significantly increased compared to TNF-α-induced group (all P<0.05). Moreover, Chuan-huang mixtures could significantly decrease TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions in protein levels (all P<0.05). Conclusion Chuan-huang mixtures dose not only promote the cells proliferation, but also inhibit expressions of IL-6 and IL-8 in HPMCs cultured under inflammatory conditions.

Key words:Chuan-huang mixtures; Rhubarb; Ligustrazine; Interleukin-6; Interleukin-8; acute peritonitis

[收稿日期]2015-11-25

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)11-1169-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.008

[基金项目]南京市医学科技发展项目(YKK14144)

[作者简介]朱桂松，男，主治医师，博士，主要从事危重病的基础和临床研究。