山楂叶总黄酮对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

袁　芳

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)



山楂叶总黄酮对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

袁芳

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

[摘要]目的研究山楂叶总黄酮(HLF)对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡的影响。方法无菌环境下分离3日龄的SD乳鼠心肌细胞，培养72 h后分组进行干预：空白对照组、H2O2干预组、山楂叶总黄酮50 μg/mL+H2O2干预组、山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2干预组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2干预组、舒血宁注射液100 μg/mL+H2O2干预组，每组设10个复孔。干预6 h后，通过显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞存活率；应用生化分析仪检测培养液中谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量；应用紫外可见分光光度计测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量；应用流式细胞术测定细胞凋亡率；并应用Western blot法检测心肌细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达并进行半定量分析。结果与H2O2干预组比较，山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2干预组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2干预组乳鼠心肌细胞形态明显好转，细胞存活率显著升高，AST、CPK、LDH释放量显著降低，细胞中SOD、CAT活性显著升高， MDA含量显著降低，caspase-3表达量及细胞凋亡率显著降低，并且山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2干预组GSH-Px活性显著升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论山楂叶总黄酮对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡具有改善作用。

[关键词]山楂叶总黄酮；H2O2；心肌细胞；氧化应激；凋亡

山楂叶是我国传统中药，其主要有效成分为山楂叶总黄酮(Hawthorn leaves flavonoids，HLF)，包括芦丁、槲皮素、金丝桃甙、牡荆素等成分[1]。闵清等[2]研究发现，山楂叶总黄酮能够有效改善机体抗氧化酶活性，提高自由基清除能力，从而表现出良好的抗氧化作用；毛晓霞等[3]研究发现，山楂叶总黄酮具有抑制脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的作用，可调节血脂的生物学活性[4]。本实验旨在观察山楂叶总黄酮对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡的影响，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1动物SPF级雄性SD 大鼠，3日龄，由河北省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2药物与试剂山楂叶总黄酮(山西晋城中晋药业有限公司，批号：20140819，总黄酮含量≥95%)；舒血宁注射剂(神威药业有限公司，批号：Z1403028)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；甲基四唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)；谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)检测试剂盒及AnnexinV/PI 细胞凋亡检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；caspase-3单体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天生物技术有限公司)；其余试剂均为分析纯。

1.3主要仪器超净工作台(江苏苏净集团)；CO2培养箱(日本三洋集团和美国Thermoscientific公司)；-20 ℃冰箱(河南新飞电器公司)；超速低温离心机(德国Kendro公司)；常温离心机(上海安亭科学仪器厂)；酶标仪(美国 BIO-RAD公司)；UV-1800 PC型紫外可见分光光度计(广州科晓科学仪器有限公司)；FACSAria流式细胞仪(美国BD公司)；DYY-11 型多用电泳仪和DYCZ-40B 转印泳槽(北京六一仪器厂)。

1.4细胞的分离与培养参照李澎等[5]报道的方法分离并培养乳鼠心肌细胞：无菌条件下摘取乳鼠心脏并剪取同一部位心室组织，剪碎后加入0.1%胰酶，37 ℃振荡消化5 min，去上清，取沉淀继续用0.1%胰酶于37 ℃振荡消化5 min，如此循环直至组织碎块消化完毕，2 000 r/min离心10 min，取沉淀，加入心肌细胞培养基，壁立1.5 h后收集未贴壁细胞，调整细胞至 6×108L-1，接种于培养器皿中，37 ℃、5%CO2、100%湿度培养72 h后用于实验。

1.5细胞分组与给药取1.4处理后状态良好的原代乳鼠心肌细胞，分为空白对照组、H2O2(100 μg/mL)干预组、山楂叶总黄酮50 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组、舒血宁注射液100 μg/mL+H2O2组，每组设10个复孔，分别给予相应药物进行干预。

1.6观察项目

1.6.1细胞形态观察药物干预6 h后，弃培养液，经PBS溶液冲洗2次后，用去离子水洗剂，直至显微镜下细胞间隙清晰为止，晾干后于光学显微镜下观察细胞形态。

1.6.2细胞存活率检测给药干预6 h后，通过MTT比色检测细胞存活率：将心肌细胞接种于 96孔培养板中，每组设8个复孔，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min后通过酶标仪测定每组细胞于波长490 nm 处吸光度(OD)值，然后计算心肌细胞存活率。心肌细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.6.3培养液中AST、CPK、LDH含量的检测干预6 h后，取细胞培养液，按照各试剂盒操作方法步骤，通过紫外可见分光光度计测定各组细胞培养液中AST、CPK、LDH含量。

1.6.4细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量检测干预6 h后，弃培养基并迅速刮取细胞，每孔加入2 mL PBS，冰浴中通过超声细胞粉碎仪处理30 s后，3 500 r/min低温(4 ℃)离心10 min，取上清液，然后严格按试剂盒步骤操作，通过紫外可见分光光度计测定各组细胞裂解液中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.6.5细胞凋亡的检测干预6 h后，用0.25%胰酶消化，1 500 r/min离心5 min后弃上清液，PBS溶液润洗2次，离心取细胞；按照细胞凋亡检测试剂盒操作说明，通过流式细胞仪检测细胞凋亡状况，最后在流式二维图中计算凋亡率。

1.6.6细胞中caspase-3表达的检测干预6 h后，经PBS清洗3次，加入0.2 mL冷裂解缓冲液，超声碎裂细胞。12 000 r/min低温(4 ℃)离心20 min， 通过BCA法进行蛋白定量，蛋白变性后上样，电泳，待溴酚蓝接近胶底部时停止电泳；转膜、春红溶液染色，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(caspase-3，β-actin)4 ℃过夜。洗膜，二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色，实验结果应用 Quantity One 软件进行分析。

2结果

2.1各组细胞形态表现光学显微镜下观察发现：空白对照组细胞形态未见异常，呈单层簇状生长，伪足多而饱满，搏动明显、节律一致；而H2O2干预组细胞细胞形态明显异常，伪足减少，大量心肌细胞脱落、溶解坏死，搏动减弱，频率降低；各给药组干预后细胞形态明显改善，其中以山楂叶总黄酮200 μg/mL组效果最为显著。见图1～6。

图1　空白对照组心肌细胞形态

2.2各组细胞存活率比较空白对照组细胞存活率为(96.3±5.4)%，H2O2干预组为(46.1±9.8)%，山楂叶总黄酮50 μg/mL+H2O2组为(53.7±11.2)%，山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组为(67.4±10.5)%，山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组为(85.5±13.1)%，舒血宁注射液100 μg/mL+H2O2组为(76.9±12.0)%。H2O2干预组细胞存活率明显低于空白对照组(P<0.05)；山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组和山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组心肌细胞存活率明显高于H2O2干预组(P均<0.05)。

图2　H2O2干预组心肌细胞形态

图3　山楂叶总黄酮50 μg/mL+H2O2组心肌细胞形态

图4　山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组心肌细胞形态

图5　山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组心肌细胞形态

图6　舒血宁注射液100 μg/mL+H2O2组心肌细胞形态

2.3各组细胞培养液中AST、CPK、LDH含量比较H2O2干预组培养液中AST、CPK、LDH含量均明显高于空白对照组(P均<0.05)；山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组和舒血宁注射液100 μg/mL + H2O2组培养液中AST、CPK、LDH含量均明显低于H2O2干预组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组心肌细胞培养液中AST、CPK、

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与H2O2干预组比较，P<0.05。

2.4各组细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比较H2O2干预组细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性明显低于空白对照组(P均<0.05)，MDA含量明显高于空白对照组(P<0.05)；山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组心肌细胞中SOD、CAT活性明显高于H2O2干预组(P均<0.05)，MDA含量明显低于H2O2干预组(P均<0.05)；山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组干预组GSH-Px活性和舒血宁注射液100 μg/mL + H2O2组SOD、MDA含量明显高于H2O2干预组(P均<0.05)。见表2。

2.5各组细胞凋亡率比较空白对照组、H2O2干预组、山楂叶总黄酮50 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组、舒血宁注射液100 μg/mL + H2O2组细胞凋亡率分别为(4.9±0.7)%，(50.8±10.9)%，(44.6±8.3)%，(23.1±5.6)%，(17.5±4.2)%，(18.9±5.3)%。H2O2干预组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P<0.05)；山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组、舒血宁注射液100 μg/mL + H2O2组心肌细胞凋亡率均明显低于H2O2干预组(P均<0.05)。见图7。

2.6各组细胞caspase-3表达情况通过Western blot方法检测发现，空白对照组、H2O2干预组、山楂叶总黄酮50 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组、舒血宁注射液100 μg/mL+H2O2组caspase-3表达量分别为1.0±0.1，2.1±0.3，1.9±0.2，1.6±0.2，1.3±0.1，1.4±0.2。H2O2干预组细胞中caspase-3表达量明显高于空白对照组(P<0.05)；山楂叶总黄酮100 μg/mL+H2O2组、山楂叶总黄酮200 μg/mL+H2O2组、舒血宁注射液100 μg/mL + H2O2组心肌细胞中caspase-3表达量均明显低于H2O2干预组(P均<0.05)。见图8。

表2　各组细胞SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比较

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与H2O2干预组比较，P<0.05。

图7　各组心肌细胞凋亡状况

图8　各组H2O2诱导乳鼠心肌细胞caspase-3表达情况

3讨论

急性心肌梗死是目前严重危害人类生命健康的主要疾病之一，通过溶栓以及介入手术等方法能够及时恢复血流再灌注，但恢复血流供应后，随着氧的涌入，自由基大量生成与过剩而将诱发氧化应激损伤，进而导致细胞凋亡[6-7]，往往最终导致组织损伤加重，此为“再灌注损伤”[8-9]重要的病理机制之一。

SOD被称为体内氧自由基的“清道夫”，能够提供氢原子配体而催化还原氧自由基生成过氧化氢[10]，并且在GSH-Px和CAT催化作用下能够被进一步还原生成对人体无害的水和氧[11]；不饱和脂肪酸为细胞膜主要组成部分，极易受氧自由基的攻击发生脂质过氧化而生成MDA，所以培养液中MDA含量能够间接反映细胞膜氧化应激损伤程度。生理状态下，血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量非常低，但心肌细胞受损后，心肌酶迅速释放入血导致血清中含量陡然增高，因此心肌酶学检查是临床上诊断心肌细胞损伤的重要技术手段[12]。

山楂叶总黄酮是指从山楂树的叶子中提取的黄酮类化合物的总称，具有抗氧化、调节血脂、抗脑组织缺血等多种药理学作用。本实验通过分离培养原代乳鼠心肌细胞，设空白对照组和H2O2干预组作为对照研究发现，山楂叶总黄酮干预6 h能够有效改善H2O2损伤乳鼠心肌细胞形态，提高细胞存活率，下调细胞凋亡介导蛋白caspase-3表达，降低细胞凋亡率；改善细胞中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性，降低培养液中MDA和心肌酶(AST、CPK、LDH)含量。提示山楂叶总黄酮对H2O2损伤乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡具有抑制作用，作用机制可能与其能够有效改善抗氧化酶活性、增强自由基清除能力、抑制氧化应激损伤、下调caspase-3、降低细胞凋亡率有关。

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Effects of hawthorn leaves favonoids on oxidative stress and cardiomyocytes apoptosis of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2

YUAN Fang

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of hawthorn leaves favonoids(HLF) on oxidative stress and cardiomyocytes apoptosis of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2. Methods Cadiocytes of neonate rat was separated and cultivated for 72 hours and divided into six groups: normal control group, H2O2 group, HLF(50, 100 and 200 μg/mL)+H2O2 groups and Shuxuening injection (100 μg/mL)+H2O2 group (n=10). 6 hours later, the morphology changes was observed under microscope and the survival rate was detected by MTT method; the content of AST, CPK, LDH in culture medium were detected by biochemistry analyzer; the activity of SOD, CAT, GSH-Px and the content of MDA in cardiomyocytes were also determinted by ultraviolet-visible spectrophotometer; the apoptosis rate were detected by flow cytometry, and the expression of caspase-3 in cardiomyocytes was detected by Western Blot and Semi-quantitative analyzed. Results Compared with the H2O2 group, the morphology of cardiomyocytes in HLF(100, 200 μg/mL)+H2O2 groups were improved and the survival rate was significantly increased, the activity of AST, CPK, LDH in culture medium were significantly decreased, the activity of SOD, CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased, the expression of caspase-3 and the apoptosis rate were significantly decreased; the activity of GSH-Px in cardiomyocytes of HLF 200 μg/mL treatment group was increased, the differences were all significant(P all<0.05). Conclusion HLF had protective effects on oxidative stress and cardiomyocytes apoptosis of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2.

Key words:HLF; H2O2; cardiomyocytes; oxidative stress; apoptosis

[收稿日期]2015-09-27

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)04-0368-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.008

[作者简介]袁芳，女，硕士，主治医师，主要从事心内科临床诊治工作。