葛根素对肾脏缺血再灌注大鼠肾脏氧化应激损伤的影响及其机制研究

朱敏杰

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)



葛根素对肾脏缺血再灌注大鼠肾脏氧化应激损伤的影响及其机制研究

朱敏杰

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

[摘要]目的研究葛根素对肾脏缺血再灌注大鼠肾脏氧化应激损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。方法将120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、葛根素25 mg/kg组、葛根素50 mg/kg组、葛根素100 mg/kg组、银杏叶提取物(100 mg/kg)组；除假手术组外，其余各组均通过夹闭双侧肾蒂血管45 min后松夹恢复血流再灌注的方法制备肾缺血再灌注模型；再灌注后各给药组立即腹腔注射给药，每天1次，连续2周，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。末次给药后，测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)及总抗氧化能力(T-AOC)水平；通过苏木精-尹红(HE)染色观察肾脏组织病理形态学变化；通过原位末端标记法(TUNEL)观察肾小球细胞凋亡状况并计算凋亡指数；检测肾脏组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量；通过RT-PCR法测定肾脏组织中bax和bcl-2 mRNA表达量，并计算bax/bcl-2比值。结果葛根素50，100 mg/kg组血清BUN、SCr、UA含量均明显低于模型组(P均<0.05)；各给药组大鼠肾脏组织病理形态学变化和肾小球细胞凋亡状况呈不同程度改善，以葛根素100 mg/kg组效果最为显著；葛根素50，100 mg/kg组大鼠肾小球细胞凋亡指数及肾脏组织中bax mRNA表达量、MDA含量及bax/bcl-2比值均明显低于模型组(P均<0.05)，肾脏组织中SOD、CAT活性及bcl-2 mRNA表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，其中葛根素100 mg/kg组血清T-AOC水平和肾脏组织中GSH-Px活性均显著高于模型组(P均<0.05)。结论葛根素对肾脏缺血再灌注大鼠肾脏氧化应激和细胞凋亡具有抑制作用；作用机制可能与其能够改善肾脏组织抗氧化酶活性、促进抗凋亡基因bcl-2表达、抑制促凋亡基因bax表达并降低bax/bcl-2比值有关。

[关键词]葛根素；肾脏；缺血再灌注；氧化应激；凋亡；银杏叶提取物

肾脏是血流量丰富的组织器官，对缺血再灌注损伤非常敏感，缺血再灌注损伤是肾脏手术、严重出血、休克后常见的并发症，是导致肾衰竭的危险因素之一[1]。目前关于肾缺血再灌注损伤的发病机制尚未明确，但近年来有研究发现氧化应激以及继发的细胞凋亡在缺血再灌注损伤发生发展过程中发挥着非常重要的作用[2-3]。葛根素为我国传统中药葛根的主要有效成分，具有抗氧化、抗炎、调脂、抗凋亡等多种生物学活性[4-6]。本实验采用夹闭双侧肾蒂血管45 min后松夹恢复血流再灌注的方法制备肾缺血再灌注大鼠模型，研究葛根素对肾缺血再灌注大鼠肾脏氧化应激和细胞凋亡的影响。现报道如下。

1实验资料

1.1药物与试剂葛根素注射液(江西银涛药业有限公司，规格：2 mL/100 mg，批号: 20140518)；金纳多注射液(德国威玛舒培大药厂，5 mL/支，含有银杏提取物17.5 mg，批号:1514904)；血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、尿酸(UA)测定试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；bax和bcl-2 mRNA RT-PCR检测试剂盒(大连Takara公司)；TUNEL染色试剂盒(北京博奥森公司)；乌拉坦购自北京化学试剂公司。

1.2实验动物清洁级雄性SD大鼠120只，7周龄，体质量180～220 g，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，动物批号：20140803。

1.3主要仪器UV-1200 型紫外可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；UV759紫外可见分光光度计(上海圣科仪器设备有限公司)；BS-200型生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)；FA25型匀浆机(上海洽姆仪器科技有限公司)；倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；PCR仪(美国 Bio-Rad公司)；台式离心机(深圳市赛泰克生物科技有限公司)。

1.4分组与造模方法将120只大鼠随机分为假手术组、模型组、葛根素25 mg/kg组、葛根素50 mg/kg组、葛根素100 mg/kg组、银杏叶提取物(100 mg/kg)组，每组20只；除假手术组外，其余各组大鼠均参照Chatterjee等[7]报道的方法制备肾缺血再灌注大鼠模型：腹腔注射乌拉坦实施麻醉，于脊柱双侧行肾区切口，剥离暴露双侧肾脏，使用无创动脉夹夹闭双侧肾蒂血管，45 min后松夹恢复血流再灌注，然后逐层缝合；假手术组大鼠行手术通路，除不夹闭肾蒂血管外，其余操作同模型组。再灌注后，各给药组立即腹腔注射给药，每天1次，连续2周，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。

1.5观察项目

1.5.1血清BUN、SCr、UA和T-AOC水平测定末次灌胃后24 h，腹腔注射乌拉坦实施麻醉，开腹经腹主动脉取血并离心取血清，按照试剂盒操作步骤，通过生化分析仪测定各组大鼠血清BUN、SCr、UA水平，并通过紫外可见分光光度计测定各组大鼠血清T-AOC水平。

1.5.2肾脏组织形态学观察取血完成后，摘取肾脏组织，其中左肾经4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片(厚度5 μm)和展片处理后，行常规HE染色，通过倒置光学显微镜观察肾脏组织形态学变化。

1.5.3肾小球细胞凋亡的观察及凋亡指数的计算取1.5.2步骤制备的石蜡组织切片，按TUNEL试剂盒方法步骤进行染色处理，通过倒置光学显微镜观察各组大鼠肾小球细胞凋亡状况。每张染色组织切片随机选取6个视野，计数每个视野中肾小球细胞总数以及阳性着色细胞数(细胞核黄染)，取平均值，然后计算凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5.4肾脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的测定参照1.5.2步骤摘取右肾组织，每组随机取10只大鼠右肾组织剪碎、加入适量冷裂解液研磨匀浆，经3 000 r/min离心10 min后取上层液，根据试剂盒操作方法，通过紫外可见分光度计分别测定各组大鼠肾脏组织匀浆中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.5.5肾脏组织中bax、bcl-2 mRNA表达的测定及bax/bcl-2比值的计算①取1.5.4步骤每组剩余10只大鼠的右肾组织，加入适量TRIZOL试剂后进行研磨匀浆；室温静置5 min后加入适量氯仿，摇匀后静置5 min，于12 000 g、4 ℃离心15 min；取上清液，加入等体积的异丙醇后静置10 min，12 000 g、4 ℃离心10 min，弃上清液；加入适当75%乙醇清洗沉淀，12 000 g、4 ℃离心5 min；弃上清保留沉淀。②引物的设计与合成：从基因文库中查到大白鼠bcl-2、bax基因cDNA序列，应用Oligo软件程序设计上、下游引物。bcl-2引物：上游5’-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3’，下游5’-TGATTTGACCATTTGCCTGA-3’，扩增的目的片段长度325 bp；Bax引物：上游5’-ATC CAGGATCGAGCAGGGAG GATGG-3’，下游5’-AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3’，目的片段长度436 bp；β-actin引物：上游5’-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3’，下游5’-CCATCT CTTGCTCGAA GTCT-3’，目的片段长度 260 bp。③采用荧光定量RT-PCR方法检测大鼠肾脏组织bax、bcl-2 mRNA表达量：取4 μL CDNA模板，SYBR Green I试剂25 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，0.5 μL Taq酶(5 IU/μL)。加双蒸水至50 μL，再加石蜡油20 μL，瞬时离心2 s，放入ABI 5700型实时荧光定量PCR扩增仪中进行PCR反应。扩增完毕读取Ct值，进行溶解曲线分析，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物特异性。mRNA定量：采用相对定量法，以β-actin为参照，利用Ct值计算bax、bcl-2 mRNA的相对量，计算公式：X mRNA=2Ct(X)-Ct (β-actin)。

2结果

2.1各组大鼠血清BUN、SCr、UA水平比较模型组大鼠血清BUN、SCr、UA水平明显高于假手术组(P均<0.05)；葛根素50，100 mg/kg 组和银杏叶提取物组血清BUN、SCr、UA水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清BUN、SCr、UA水平比较

注：①与假手术组比较,P<0.05；②与模型组比较,P<0.05。

2.2各组大鼠肾脏组织病理表现假手术组大鼠肾小球结构和肾脏细胞形态均未见异常；而模型组大鼠肾小球体积增大、系膜增生，细胞呈空泡变性，间质区可见淋巴细胞浸润等；各给药组大鼠肾脏组织病变均较模型组明显改善，其中以葛根素100 mg/kg组效果最为显著。见图1～6。

图1　假手术组大鼠肾脏组织形态学表现(HE，×200)

图2　模型组大鼠肾脏组织形态学表现(HE，×200)

图3　葛根素25 mg/kg组大鼠肾脏组织形态学表现(HE，×200)

图4　葛根素50 mg/kg组大鼠肾脏组织形态学表现(HE，×200)

图5　葛根素100 mg/kg组大鼠肾脏组织形态学表现(HE，×200)

图6　银杏叶提取物组大鼠肾脏组织形态学表现(HE，×200)

2.3各组大鼠肾小球细胞凋亡情况比较假手术组大鼠肾脏组织存在极少量的凋亡细胞；而模型组大鼠肾小球细胞凋亡数量明显增多，各给药组大鼠肾小球细胞凋亡数量均明显减少，其中以葛根素100 mg/kg组最为显著，见图7～12。假手术组大鼠肾脏组织细胞凋亡指数为(2.5±1.1)%，模型组为(53.7±8.0)%，葛根素25,50,100 mg/kg组分别为(48.5±8.6)%，(34.2±7.3)%和(16.9±4.8)%，银杏叶提取物组为(30.1±5.7)%。模型组大鼠细胞凋亡指数明显高于假手术组(P<0.05)，葛根素50,100 mg/kg组和银杏叶提取物组大鼠细胞凋亡指数均明显低于模型组(P均<0.05)。

图7　假手术组大鼠肾脏组织细胞凋亡表现(HE，×400)

图8　模型组大鼠肾脏组织细胞凋亡表现(HE，×400)

图9　葛根素25 mg/kg组大鼠肾脏组织细胞凋亡表现(HE，×400)

图10　葛根素50 mg/kg组大鼠肾脏组织细胞凋亡表现(HE，×400)

2.4各组大鼠血清T-AOC水平比较假手术组大鼠血清T-AOC水平为(7.3±1.8)IU/L，模型组为(3.6±1.2)IU/L，葛根素25,50和100 mg/kg组分别为(5.6±1.5)IU/L、(6.0±1.5)IU/L和(6.8±1.6)IU/L，银杏叶提取物组为(6.3±1.6)IU/L。模型组血清T-AOC水平明显低于假手术组(P<0.05)，葛根素100 mg/kg组血清T-AOC水平明显高于模型组(P<0.05)。

2.5各组大鼠肾脏组织匀浆中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA水平比较模型组大鼠肾脏组织匀浆中SOD、GSH-Px、CAT活性均明显低于假手术组(P均<0.05)，MDA含量明显高于假手术组(P<0.05)；葛根素50，100 mg/kg 组肾脏组织匀浆中SOD、CAT活性明显高于模型组， MDA含量明显低于模型组，其中葛根素100 mg/kg 组GSH-Px活性明显高于模型组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

图12　银杏叶提取物组大鼠肾脏组织细胞凋亡表现(HE，×400)

表2　各组大鼠肾脏组织匀浆中SOD、GSH-Px、

注：①与假手术组比较,P<0.05；②与模型组比较,P<0.05。

2.6各组大鼠肾脏组织中bax、bcl-2 mRNA表达及bax/bcl-2比值比较模型组大鼠肾脏组织中bax、bcl-2 mRNA表达量及bax/bcl-2比值均明显高于假手术组(P均<0.05)；葛根素50，100 mg/kg 组和银杏叶提取物组大鼠肾脏组织中bax mRNA表达量明显低于模型组(P均<0.05)， bcl-2 mRNA表达量和 bax/bcl-2比值明显高于模型组(P均<0.05)。见表3。

3讨论

肾缺血再灌注损伤是临床上常见的并发症，已引起广大医药工作者的广泛关注。胡红林等[8]研究发现，肾缺血再灌注损伤的发生发展与氧自由基的大量生成、过剩而诱发的肾脏组织氧化应激损伤以及继发的细胞凋亡密切相关。唐群等[9]研究发现，通过药物干预氧化应激损伤能够有效减轻肾缺血再灌注损伤；傅耀文等[10]研究发现，通过药物抑制肾组织细胞的凋亡也能够有效缓解肾缺血再灌注损伤。

表3　各组大鼠肾脏组织中bax、bcl-2 mRNA表达及

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

正常生理状态下，体内生成的氧自由基能够在SOD和GSH-Px、CAT的逐步催化作用下被还原[11-13]，最终生成对人体无害的水和氧。血清中T-AOC水平能够反映机体整体抗氧化能力，而MDA也能够间接反映机体氧化应激损伤程度。bcl-2和bax都属于bcl-2基因家族，bcl-2为凋亡抑制基因,bax为促凋亡基因，二者共同调控细胞凋亡[14]；且bax/bcl-2比值越高，往往凋亡状况越严重[15]。

本实验结果显示，葛根素能够有效降低血清BUN、SCr、UA含量，改善肾功能，改善肾脏组织病变，抑制肾小球细胞凋亡，改善肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性，减轻氧化应激损伤，上调抗凋亡基因bcl-2表达,下调促凋亡基因bax表达，降低bax/bcl-2比值。提示葛根素具有抑制肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织氧化应激和细胞凋亡的作用，作用机制可能与葛根素能够有效改善肾脏组织抗氧化酶活性、提高抗凋亡基因bcl-2表达、抑制促凋亡基因bax表达并降低bax/bcl-2比值有关。

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Study on the effects and the mechanism of puerarin on oxidative stress injury induced by renal ischemia-reperfusion in rats

ZHU Minjie

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of puerarin on oxidative stress induced by renal ischemic-reperfusion in rats, and investigate its mechanism. Methods One hundred and twenty SD rats were randomly divided into six groups: sham operation group, model group, puerarin 25, 50, 100 mg/kg group and ginkgo biloba extract (EGb) 100 mg/kg group; except sham operation group, the rats in other groups were all made renal ischemic-reperfusion rat models by gripping bilateral renal pedicle vascular for 45 min, the drugs were given immediately after reperfusion, once a day for 2 weeks. Two weeks later, the content of BUN, SCr, UA and the level of T-AOC in serum were detected; the renal tissue histopathological changes was observed by HE staining; the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining, and the apoptosis index (AI) was calculated; the activity of SOD, GSH-Px, CAT and the content of MDA in the renal tissue were measured; the expression level of Bax, bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR, and the bax/bcl-2 was calculated. Results Compared with the model group, the content of BUN, SCr, UA in serum of puerarin 50, 100 mg/kg group were significantly decreased (all P<0.05); the histopathological changes and the apoptosis of the renal tissue in puerarin 25, 50 100 mg/kg group and EGB 100 mg/kg group were significantly improved, the effect of puerarin 100 mg/kg group was the most significant; in the puerarin 50, 100 mg/kg group, the AI and bax mRNA expression, MDA content and bax/bcl-2 ratio in renal tissue were significantly lower than those in the model group (all P<0.05), and the expression levels of SOD, CAT and Bcl-2 mRNA in renal tissues were significantly higher than those in the model group (all P<0.05), the serum T-AOC level and GSH-Px activity in renal tissue of puerarin 100 mg/kg group were significantly higher than those in the model group (all P<0.05). Conclusion Puerarin has inhibitive effects on renal oxidative stress and apoptosis, the mechanism may be related to improving the activity of antioxidant enzymes in renal tissue, promoting the expression of anti-apoptotic gene Bcl-2, inhibiting the expression of pro-apoptotic gene Bax and reducing the ratio of bax/bcl-2.

Key words:puerarin; kidneys; ischemic-reperfusion; oxidative stress; apoptosis; ginkgo biloba extract

[收稿日期]2015-07-08

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)06-0585-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.005

[作者简介]朱敏杰，女，主治医师，从事肾疾病研究工作。