miR-200a靶向调控AP-2γ表达抑制神经母细胞瘤SK-N-AS细胞增殖

高顺利，王立忠，刘海英，刘丹莉



miR-200a靶向调控AP-2γ表达抑制神经母细胞瘤SK-N-AS细胞增殖

高顺利，王立忠，刘海英，刘丹莉

摘要：目的明确miR-200a具有靶向调控转录因子活化蛋白（AP）-2γ表达而抑制神经母细胞瘤细胞增殖的能力，进一步揭示miR-200a抗瘤的分子机制。方法通过双荧光素酶报告基因分析检测miR-200a对AP-2γ 3′UTR-荧光素酶活性的影响；将miR-200a模拟物转染神经母细胞瘤细胞，利用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹（Western blot）方法检测AP-2γ表达水平的改变；将AP-2γ shRNA转染SK-N-AS细胞，MTS细胞增殖活性检测分析干扰AP-2γ表达对神经母细胞瘤细胞增殖能力的影响；将AP-2γ重组质粒与miR-200a模拟物共转染神经母细胞瘤细胞，通过MTS检测细胞增殖能力。结果miR-200a处理组细胞活性(66.33±5.13)与对照组的(100±0)相比，细胞增殖受到明显抑制（F=114，P＜0.05）。与未转入的相对荧光素酶活性（0.982±0.119）相比，miR-200a转染明显抑制AP-2γ的3′UTR驱动的荧光素酶活性（0.624±0.051）。且miR-200a模拟物明显降低神经母细胞瘤细胞中AP-2γ的mRNA和蛋白表达水平；此外，与对照组相比，shRNA干扰AP-2γ表达能明显抑制SK-N-AS细胞的增殖(62.5±2.4)，它能部分模拟miR-200a的抑制增殖能力。最后，发现过表达AP-2γ能部分逆转miR-200a对SK-N-AS细胞的增殖抑制作用（92.4±1.4）。结论miR-200a通过靶向下调AP-2γ表达而抑制神经母细胞瘤细胞的增殖。

关键词：神经母细胞瘤；微RNAs；细胞增殖；AP-2γ；miR-200a

微小RNA(miR)-200家族包括miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b和miR-200c，5个成员，它们具有高度的同源性[1]。在人类中miR-200a定位于1号染色体[2]，miR-200家族可以提高某些癌细胞的增殖能力[3]。小鼠乳腺肿瘤细胞中可以检测到miR-200家族高表达，过表达miR-200a可使没有侵袭能力的乳腺癌细胞获得侵袭能力，然而miR-200a在神经母细胞瘤中的功能和作用机制未知[4-5]。本研究采用生物信息学靶基因预测、逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）等分子生物学技术，旨在证实miR-200a通过直接靶向调控转录因子活化蛋白（AP）-2γ的mRNA和蛋白质表达而抑制神经母细胞瘤细胞增殖，从而揭示miR-200a在神经母细胞瘤中的抗瘤功能和分子机制。

1　材料与方法

1.1主要材料RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。miR-200a模拟物及对照模拟物购自Ambion公司。AP-2γ的shRNA购自Santa Cruz公司。AP-2γ的过表达质粒、AP-2γ的3′UTR的各种报告基因（Mre vector，Wild-AP-2γ-3′UTR vector，Mut-AP-2γ-3′UTR vector）以及双报告基因载体购自复能基因公司。双荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司。AP-2γ抗体和β-actin抗体购自CST公司。Trizol和Lipofectamine 2000转染试剂购自美国life公司。RPMI1640培养基和胎牛血清为Gibco公司产品。MTS细胞增殖/毒性检测试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2MTS法检测细胞增殖活性分别将miR-200a的模拟物和对照模拟物转染至神经母细胞瘤SK-N-AS细胞株，或者转染miR-200a的模拟物后过表达AP-2γ的表达质粒再转染至神经母细胞瘤SK-N-AS细胞株，实验分为4组。不作任何转染的为空对照组，转染miR-200a模拟物和对照模拟物的分别为miR-200a处理组和对照组，而转染miR-200a的模拟物后过表达AP-2γ的为过表达组。待细胞贴壁过夜后，消化细胞接种于96孔板中，每孔5 000个细胞，每组设6个复孔，放37℃、5% CO2培养箱中培养。培养72 h后，每孔加20 μL MTS检测试剂，37℃孵育2 h，用酶标仪测定492 nm波长的光密度值(OD492)。增殖活性=（处理组OD492/对照组OD492）×100%。

1.3荧光素酶活性检测将各种荧光素酶报告质粒与miR-200a模拟物共转染SK-N-AS细胞，转染48 h后收获细胞。按Promega公司双荧光素酶活性检测试剂盒说明书在检测仪检测细胞荧光素酶活性。其中，对照组转染双报告基因空白载体；Mre组为转染单纯的miR-200a反应元件驱动的荧光素酶报告载体；野生型组和突变型组分别为转染AP-2γ的3′UTR和Mre缺失突变的AP-2γ的3′UTR-荧光素酶报告载体。荧光素酶活性比值=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.4RT-PCR检测以转染对照模拟物为阴性对照（miRNC），不转染任何载体的为空对照(Mock)，转染miR-200a模拟物的为miR-200a处理组，而转染AP-2γ-shRNA的为干扰组。细胞总RNA按Trizol试剂盒说明书常规提取。逆转录反应按大连宝生物工程公司逆转录试剂盒说明书进行，PCR按试剂盒说明书进行，扩增体系50µL。反应条件：

95℃5min；95℃15 s；65℃20 s；72℃30 s；30个循环；72℃10 min。AP-2γ引物：上游5′-TGACCAAGAACCCTCT⁃GAACCT-3′；下游5′-CCAGGGACTGAGCAGAAGAC-3′，产物88 bp。GAPDH引物：上游5′-ACCCAGAAGACTGTG⁃GATGG-3′；下游5′-ACGCCTGCTTCACCACCTTC-3′，产物247 bp。

1.5Western blot实验分为以转染对照模拟物为阴性对照（miR-NC），不转染任何载体的为空对照(Mock)，转染miR-200a模拟物组（miR-200a处理组），或AP-2γ shRNA转染组（干扰组）和AP-2γ过表达质粒转染组（过表达组），分别在48 h后提取细胞总蛋白或96 h后采用MTT法分析细胞增殖活性，并用BCA法测定蛋白浓度。各组取等量样本，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，5% BSA封闭，加入AP-2γ抗体或GAPDH抗体，4℃过夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECL发光剂，X线片曝光、显影、定影。

1.6统计学方法采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析。所有结果均以均数±标准差（x ±s）表示。组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-200a抑制神经母细胞瘤细胞增殖3组间细胞增殖活性差异有统计学意义（F=114，P＜0.01），miR-200a处理组(66.33±5.13)与对照组的(100±0)相比，受到明显抑制（P＜0.05），而空对照组的细胞增殖活性（101±2.00）与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2荧光素酶活性检测结果人类AP-2γ的基因3′UTR上含有一个miR应答元件，能够与miR-200a相互作用，介导其转录调控，见图1。转染各种荧光素酶报告基因和miR-200a模拟物后，与对照组相比，野生型组和Mre组的荧光素酶活性比值显著下降，而突变型组的荧光素酶活性比值没有明显变化，见表1。

Fig. 1 Schematics of the target genes of miR-200a and the luciferasereport constructs图1　miR-200a作用的靶基因示意图以及各种荧光素酶报告载体构建示意图

Tab. 1 miR-200a regulates luciferase activity driven by AP-2γ 3′UTR report constructs mediated by binding to the MRE element of promotor of AP-2γ表1　Mre元件介导了miR-200a对AP-2γ的3′UTR驱动的荧光酶活性调控

2.3miR-200a下调AP-2γ的mRNA和蛋白表达水平转染miR-200a组的AP-2γ mRNA和蛋白表达水平较对照组明显降低，并且其下调水平与AP-2γ干扰组的大致相当，见图2、3。

Fig. 2 AP-2γ mRNA expression detected by RT-PCR图2　RT-PCR检测AP-2γ的mRNA表达

Fig. 3 AP-2γ protein expression detected by Western blot assay图3　Western blot检测AP-2γ的蛋白表达

2.4下调AP-2γ表达可抑制神经母细胞瘤细胞增殖转染AP-2γ shRNA的SK-N-AS细胞AP-2γ蛋白的表达受到明显抑制，见图4。3组细胞增殖活性比较差异有统计学意义（F=282.0，P＜0.01），与对照组（100±0）相比，转染AP-2γ shRNA的神经母细胞增殖活性（62.5±2.4）受到明显抑制（P＜0.05），而空对照组的（101.0±3.1）没有明显改变（P＞0.05）。

Fig. 4 Down-regulation of AP-2γ in neuroblastoma cells SK-N-AS by shRNA of AP-2γ transfection图4　AP-2γ-shRNA转染神经母细胞SK-N-AS中下调AP-2γ的表达

2.5过表达AP-2γ逆转miR-200a对神经母细胞瘤细胞增殖抑制miR-200a明显抑制AP-2γ的表达，而AP-2γ过表达质粒转染拮抗miR-200a对AP-2γ的表达抑制，见图5。相对于空对照组的细胞活性（100±0），miR-200a处理组细胞增殖活性为81.2± 1.2，下降了近19%，而AP-2γ过表达组的增殖活性为92.4±1.4，逆转了miR-200a的抑制效应（F= 236.5，P＜0.01）。

Fig. 5 Over-expression of AP-2γ reversed down-regulation effects of miR-200a to AP-2γ expression in SK-N-AS cells图5　过表达AP-2γ逆转miR-200a对AP-2γ的下调

3　讨论

miR在神经母细胞瘤中的作用越来越引起了人们的重视。许多报道揭示miR作为一类新型基因调控分子，与神经母细胞瘤的发生发展密切相关[6]。本研究结果显示，转染miR-200a和（或）下调AP-2γ表达能抑制神经母细胞瘤细胞的增殖。而过表达AP-2γ能部分逆转miR-200a对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制作用。说明miR-200a可通过靶向调控AP-2γ表达抑制神经母细胞瘤增殖。同时也提示，除AP-2γ外，miR-200a还可能通过其他的靶基因来调控神经母细胞瘤细胞增殖。本研究揭示了miR-200a在神经母细胞瘤中的抑瘤分子机制，与Yo⁃neyama等[7]的报道一致。也有研究报道miR-200a可以通过直接靶向调控MACC1的转录进而影响肝癌的生长[8]。结合以上的结果可以认为，miR-200a可以通过直接靶向不同的靶基因表达影响不同肿瘤细胞的生长，那么miR-200a影响不同肿瘤的生长具有细胞株的特异性，其特异性产生的分子机制不明了，关于这方面的研究缺乏报道，值得今后去探讨。

AP-2蛋白是一类非常重要的转录因子，其家族通过与其靶基因启动子上的作用元件结合而控制许多靶基因的特异性表达,从而调控胚胎发育、细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种生物过程[9-11]。AP-2γ与肿瘤基因的不稳定性和肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、侵袭、药物抵抗密切相关，在肿瘤发生发展中起着重要作用[12]。本研究也发现敲低AP-2γ的表达可以明显抑制骨肉瘤细胞的生长和迁移，这与文献[13]的报道类似。但是也有研究认为AP-2γ的低表达可以促进乳腺癌细胞的生长和迁移[11]。其具体的分子机制不清楚，笔者推测AP-2γ在不同肿瘤细胞中发挥了促癌和抑制癌细胞生长的作用，可能与其调控的靶基因有关，而在本研究中AP-2γ通过影响该靶基因的表达进而调控神经母细胞瘤细胞的生长和迁移，有待下一步的研究去阐明。

本研究发现miR-200a靶向下调AP-2γ的表达，进而抑制神经母细胞瘤细胞的生长，而过表达AP-2γ能部分逆转miR-200a对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制作用。提示miR-200a可部分通过靶向调控AP-2γ表达抑制神经母细胞瘤增殖，在miR-200a影响神经母细胞瘤生长的分子机制中，可能通过多个途径实现。

参考文献

[1] Tang H, Deng M, Tang Y, et al. miR-200b and miR-200c as prog⁃nostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(20):5602- 5612.doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-1326.

[2] Zeng H, Zhu ML, Guo YB, et al. Influence of target regulation of PKCα by miR-200b on proliferation and invasion of glioma cells[J]. Med J Chin PLA,2013,38(10): 834-836.[曾晖,朱明亮,郭远波,等. miR-200b靶向调控PKCα表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响[J].解放军医学杂志,2013,38(10):834-836].doi:10.11855/j. issn.0577-7402.2013.10.011.

[3] Le MT, Hamar P, Guo C, et al. miR-200-containing extracellular vesicles promote breast cancer cell metastasis[J].J Clin Invest,2014, 124(12):5109-5128. doi:10.1172/JCI75695.

[4] Shen FJ，Su J，Zhang QY,et al. Effects of up-regulated miR-200a and miR- 141 on gastric adenocarcinoma cell growth in vitro[J]. Tianjin Med J, 2013, 41(6): 517-519.[申发娟,苏娟,张庆瑜,等.上调miR-200a、miR-141表达对胃腺癌细胞生长的体外研究[J].天津医药, 2013, 41(6):517- 519]. doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2013.06.002.

[5] Guo R，Ning XH，Jiang K, et al. Methylation of miR-200b and its effects on proliferation，invasion of gastric cancer cell line MGC-803[J]. Tianjin Med J, 2015, 43(4): 340-344. [郭蓉，宁向红，姜葵，等.甲基化调节miR-200b的表达及其对胃癌MGC-803细胞增殖侵袭能力的影响[J].天津医药，2015, 43(4): 340-344]. doi：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.002.

[6] Xue J, Niu J, Wu J, et al.MicroRNAs in cancer therapeutic re⁃sponse: Friend and foe[J].World J Clin Oncol,2014,5(4):730-743. doi: 10.5306/ wjco.v5.i4.730.

[7] Yoneyama K, Ishibashi O, Kawase R, et al. miR-200a, miR-200b and miR-429 are onco-miRs that target the PTEN gene in endome⁃trioid endometrial carcinoma[J]. Anticancer Res, 2015, 35(3):1401-1410.

[8] Feng J, Wang J, Chen M, et al. miR-200a suppresses cell growth and migration by targeting MACC1 and predicts prognosis in hepa⁃tocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2015, 33(2): 713- 720. doi: 10.3892/or.2014.3642.

[9] Choi I, Carey TS, Wilson CA, et al. Transcription factor AP-2γ is a core regulator of tight junction biogenesis and cavity formation dur⁃ing mouse early embryogenesis[J].Development,2012,139(24):4623-4632. doi:10.1242/dev.086645.

[10] Zhou C, Zhao XM, Li XF, et al. Curcumin inhibits AP-2 gamma in⁃duced apoptosis in the human malignant testicular germ cells in vi⁃tro[J]. Acta Pharmacol Sin, 2013, 34(9):1192-1200. doi:10.1038/ aps.2013.38.

[11] Williams CM, Scibetta AG, Friedrich JK, et al. AP-2 gamma pro⁃motes proliferation in breast tumour cells by direct repression of the CDKN1A gene[J]. EMBO J, 2009, 28(22):3591- 3601. doi: 10.1038/emboj.2009.290.

[12] Tan SK, Lin ZH, Chang CW, et al. AP-2 regulates oestrogen receptor mediated long range chromatin interaction and gene transcription[J]. EMBO J, 2011, 30(13) :2569-2581. doi:10.1038/emboj.2011.151.

[13] Orso F, Penna E, Cimino D, et al. AP-2alpha and AP-2gamma reg⁃ulate tumor progression via specific genetic programs[J]. FASEB J, 2008, 22(8): 2702-2714. doi: 10.1096/fj.08-106492.

（2015-07-28收稿2015-11-02修回）

（本文编辑魏杰）

实验研究

作者单位：湖南衡阳，南华大学附属第一医院儿科（邮编421001）

miR-200a inhibits cell proliferation by targeting AP-2γ expression in neuroblastoma cells SK-N-AS

GAO Shunli, WANG Lizhong, LIU Haiying, LIU Danli
Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang, Hunan 421001, China

Abstract:Objective To investigate whether miR-200a suppresses cell proliferation by targeting AP-2γ expression, and reveal molecular mechanism that miR-200a functions as a tumor-suppressor in neuroblastoma cells. Methods Dualluciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-200a on AP-2γ promotor luciferase activity. Neu⁃roblastoma cells were transfected with miR-200a mimics, and the expressions of AP-2γ mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot assay. The effects of AP-2γ down-regulation on cell proliferation were observed after AP-2γ shRNA was transfected into neuroblastoma cells. Neuroblastoma cell proliferation was detected by MTS assay after being cotransfected with miR-200a mimics and AP-2γ plasmid. Results Results showed that miR-200a could inhibit proliferation of neuroblastoma cells at cell viability (66.33±5.13) compared with that of control group (100±0), and also miR-200a can bind to the 3′untranslated region of AP -2γ promotor and inhibit its luciferase activity with an inhibit ratio at (0.624±0.051). AP-2γ mRNA and protein expressions were significantly down-regulated when miR-200a was over-expressed in neuroblas⁃toma cells. Furthermore, results showed that shRNA-mediated down-regulation of AP-2γ that suppressed the cell prolifera⁃tion of neuroblastoma at (62.5±2.4) by comparing with the control group (100±0). Moreover, restoring AP-2γ expression re⁃versed the effect of miR-200a with a cell viability suppression at (92.4±1.4). ConclusionmiR-200a suppresses cell prolif⁃eration by targeting AP-2γ expression in neuroblastoma cells.

Key words:neuroblastoma; microRNAs; cell proliferation; AP-2γ; miR-200a

中图分类号：R748

文献标志码：A

DOI：10.11958/56744

基金项目：湖南省教育厅课题（13C802）

作者简介：高顺利（1976），女，儿科副主任医师，硕士研究生，主要从事儿科肿瘤及呼吸系统疾病方面研究