不同浓度七氟醚对人前列腺癌细胞增殖与侵袭能力的影响

王国武，李超，胡啸玲



不同浓度七氟醚对人前列腺癌细胞增殖与侵袭能力的影响

王国武，李超，胡啸玲

摘要：目的观察不同浓度七氟醚对人前列腺癌PC3细胞增殖与侵袭的影响。方法将PC3细胞随机分为4组：对照组、Treat1组、Treat2组和Treat3组。对照组仅通入O2及CO2，Treat1～3组在此基础上经1.7%、3.4%、5.1%七氟醚分别作用2、4、6 h。MTT检测各组细胞的增殖能力；Transwell法检测各组细胞的侵袭能力；Western blot检测各组细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达水平。结果与处理前相比，处理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3细胞的增殖和侵袭能力均明显增强（均P＜0.05），细胞中HIF-1α的蛋白表达水平明显上调（P＜0.05），且Treat3组＞Treat2组＞Treat1组（P＜0.05）。结论七氟醚可增强人前列腺癌PC3细胞的增殖与侵袭能力，且随着时间和浓度变化细胞的增殖与侵袭能力逐渐增强，其机制可能与上调HIF-1α的表达有关。

关键词：前列腺肿瘤；麻醉，吸入；醚类；细胞增殖；肿瘤侵润；七氟醚；缺氧诱导因子-1α

外科手术是目前治疗恶性实体瘤的主要方法之一，然而术后出现转移和复发仍是导致肿瘤患者死亡的重要原因。因此，在围手术期进行干预对肿瘤患者的预后具有重要的意义[1]。近年来，有研究发现麻醉药物和麻醉技术对肿瘤细胞的增殖具有重要的影响[2-4]。七氟醚是目前临床上广泛应用的一种吸入麻醉药物，其具有可控性强、麻醉效能高等特点。因此，七氟醚在全身麻醉中占据着重要地位。研究发现，七氟醚能抑制喉癌、结肠癌、乳腺癌以及肺癌细胞的增殖与侵袭[5-7]。缺氧诱导因子（HIF）-1α在前列腺癌组织和细胞中表达上调，通过调控其下游靶基因血管内皮生长因子（VEGF）、促红细胞生成素（EPO）、趋化因子受体4（CXCR4）的表达，从而促进人前列腺癌PC3细胞的增殖与迁移，并抑制肿瘤细胞的调亡[8]。然而七氟醚与HIF-1α在前列腺癌中的关系尚少见报道。本研究拟通过采用噻唑兰（MTT）、侵袭实验以及蛋白免疫印迹（Western blot）分析并探讨两者在前列腺癌中的作用及关系。

1　材料与方法

1.1材料人前列腺癌PC3细胞株由南华大学肿瘤研究所惠赠。PRMI1640培养基与胎牛血清购自美国Hyclone公司。Datex AS/3麻醉气体监测仪购自芬兰Homeda公司。七氟醚挥发罐为SEVORANE®型，购自美国Abott公司。倒置显微镜购自日本Olympus公司。Matrigel基质胶购自美国BD公司。Transwell小室购自康宁公司。MTT粉与DMSO购自Sigma公司。HIF-1α鼠单克隆抗体与相应二抗以及βactin抗体购自美国Santa Cruz公司。蛋白浓度测定试剂盒与ECL化学发光检测试剂盒购自美国Pierce公司。硝酸纤维素膜购自英国Amersham Pharmacia公司。CO2培养箱型号为HF 212 UV，购自美国SHEL-LAB公司。

1.2方法

1.2.1实验分组与七氟醚处理细胞根据参考文献[7]预先在培养板将人前列腺癌PC3细胞培养达80%汇合度，将培养板分次置于无菌密闭有机玻璃箱内。玻璃箱两个侧壁分别安装进气口和出气口，其中进气口连接麻醉机，出气口连接麻醉气体监测仪。将PC3细胞随机分为4组：对照组、Treat1组、Treat2组、Treat3组。对照组通入95%O2与5%CO2混合气体6 L/min并维持6 h，不进行七氟醚处理。Treat1～3组通入95%O2与5%CO2混合气体6 L/min，并向容器内分别输送1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚2、4、6 h。细胞处理完成后，放入37℃、5%CO2培养箱继续培养48 h。

1.2.2MTT实验将细胞接种于96孔板中，接种浓度为5× 103/mL，每组设5个复孔，培养至临近饱和，每孔加灭菌MTT液（5 g/L）20µL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO150µL，低速振荡10 min，选择波长为570 nm，在酶标仪上测定各孔吸光度（A）值，记录结果用来反映细胞增殖情况，实验重复3次。

1.2.3Transwell侵袭实验在Transwell小室中铺加适量基质胶稀释液（稀释浓度1∶8），过夜以成膜。次日取100 μL即含1×105/mL的细胞稀释液接种至Transwell小室的上室，下室加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养36 h后取出，用棉签擦弃小室上层细胞，PBS液轻洗，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶祡染色，PBS液清洗，倒置，晾干。光学显微镜下观察并摄像，任意读取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值，实验重复3次。

1.2.4Western blot将4组细胞继续培养48 h后抽提细胞总蛋白，每组取等量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转膜，封闭1 h，加入HIF-1α抗体或β-actin抗体，4℃过夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL发光，X线片曝光、显影、定影。

1.3统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，组间、组内比较采用方差分析，多重比较采用SNK-q法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PC3细胞增殖能力的变化与处理前比较，Treat1～3组处理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3细胞的增殖能力明显增强（P＜0.05），且Treat3组＞Treat2组＞Treat1组（P＜0.05），见表1。

Tab. 1 Comparison of PC3 cell proliferation ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表1　不同七氟醚浓度组人前列腺癌PC3细胞增殖能力的比较　（n=3，±s）

Tab. 1 Comparison of PC3 cell proliferation ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表1　不同七氟醚浓度组人前列腺癌PC3细胞增殖能力的比较　（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与同组处理前比较，b与同组处理2 h比较，c与同组处理4 h比较，d与对照组比较，e与Treat1组比较，f与Treat2组比较，P＜0.05；表2同

组别对照组Treat1组Treat2组Treat3组F处理前0.447±0.079 0.451±0.014 0.457±0.018 0.466±0.021 0.249处理2 h 0.449±0.015 0.554±0.025ad0.645±0.033ade0.753±0.021adef27.910＊＊组别对照组Treat1组Treat2组Treat3组F处理4 h 0.460±0.015 0.652±0.018ad0.746±0.033abde0.847±0.018abdef55.590＊＊处理6 h 0.468±0.016 0.746±0.026ad0.845±0.017abcde0.946±0.015abcdef116.375＊＊F 0.469 35.141＊＊39.721＊＊117.912＊＊

2.2PC3细胞侵袭能力的变化与处理前比较，七氟醚处理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3细胞的侵袭能力明显增强（P＜0.05），且Treat3组＞Treat2组＞Treat1组（P＜0.05），见表2。

Tab. 2 Comparison of PC3 cell invasion ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表2　不同七氟醚浓度组人前列腺癌PC3细胞侵袭能力的比较　（n=3，个，±s）

Tab. 2 Comparison of PC3 cell invasion ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表2　不同七氟醚浓度组人前列腺癌PC3细胞侵袭能力的比较　（n=3，个，±s）

组别对照组Treat1组Treat2组Treat3组F处理前132±12 135±15 139±10 143±8 0.150处理2 h 136±16 200±16ad264±12ade328±15adef30.951＊＊处理4 h 133±13 263±16ad335±11abde396±16abdef63.493＊＊处理6 h 134±8 324±23ad408±13abcde466±13abcdef90.952＊＊F 0.019 21.087＊＊99.557＊＊108.459＊＊

2.3PC3细胞HIF-1α表达的变化与处理前比较，七氟醚处理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3细胞中HIF-1α蛋白的表达水平明显上调，且Treat3组＞Treat2组＞Treat1组，见图1。

Fig. 1 The expression of HIF-1α protein treated with different concentrations of sevoflurane in four groups图1不同七氟醚浓度对HIF-1α蛋白表达的变化

3　讨论

前列腺癌是常见的恶性肿瘤之一。目前临床上治疗前列腺癌以外科手术为主。在19世纪80年代，有研究者发现手术能促进肿瘤的生长。近年来，研究者认识到麻醉药物或麻醉方法对肿瘤患者预后以及转归具有一定影响。七氟醚广泛应用在癌症手术中的麻醉维护或麻醉诱导。七氟醚能诱导T淋巴细胞、Jurkat T细胞和H4人类神经胶质瘤细胞的凋亡[9-11]。Liang等[7]研究显示七氟醚通过下调XIAP与凋亡抑制基因Survivin并激活caspase-3，从而抑制肺癌细胞的增殖并诱导肿瘤细胞发生凋亡。然而，七氟醚在前列腺癌中的生物学作用以及机制目前尚未阐明。

本研究采用常用的七氟醚浓度和作用时间，即1.7%、3.4%、5.1%七氟醚作用人前列腺癌PC3细胞2、4、6 h，观察其对PC3细胞增殖及侵袭的影响。MTT、侵袭实验结果显示，与对照组比较，PC3细胞的增殖与侵袭能力随着时间和浓度变化逐渐增强。与以前的研究七氟醚能抑制喉癌、结肠癌、乳腺癌以及肺癌细胞的增殖与侵袭不相符。本研究提示七氟醚在前列腺癌中可能具有增强肿瘤细胞的生长与侵袭的作用。研究显示，HIF-1α在前列腺癌LNCaP细胞中过表达可诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力[12]。本研究通过Western blot发现，经1.7%、3.4%、5.1%七氟醚分别处理人前列腺癌PC3细胞2、4、6 h后，与对照组比较，HIF-1α的蛋白表达水平随着时间和浓度变化逐渐上调，表明不同浓度七氟醚均能上调HIF-1α的表达。

综上所述，七氟醚通过上调HIF-1α的表达，从而促进前列腺癌PC3细胞的增殖与侵袭。如果笔者的研究数据能外推到临床应用，七氟醚应该避免应用于前列腺癌患者的手术麻醉中。接下来的研究重点将放在构建体内模型上，以进一步验证七氟醚对前列腺癌细胞的生物学行为，为临床应用提供理论基础和实验依据。

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（2015-01-05收稿2015-07-28修回）

（本文编辑魏杰）

作者单位：衡阳，南华大学附属第一医院麻醉科（邮编421001）

The effects of different concentrations of sevoflurane on proliferation and invasion in human prostate cancer cells

WANG Guowu, LI Chao, HU Xiaoling
Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, China

Abstract:Objective To investigate the effects of different concentrations of sevoflurane on proliferation and invasion in human prostate cancer PC3 cell line. Methods The cells were randomly divided into four groups：control group and three sevoflurane groups (exposed to 1.7%, 3.4% and 5.1% sevollurane for 2, 4 and 6 h respectively). The ability of prolifera⁃tion and invasion of PC3 cells were evaluated by MTT and Transwell invasion assays. Western blot analysis was performed to detect the protein expression of hypoxia inducing factor 1 alpha (HIF-1α) in PC3 cells. Results The ability of proliferation and invasion of PC3 cells was significantly increased after being exposed to sevollurane for 2, 4 and 6 h (P＜0.05), and the expression of HIF-1α protein in PC3 cells was significantly higher after being exposed to sevollurane for 2，4 and 6 h (P＜0.05), showing the Treat 3 group＞Treat 2 group＞Treat 1 group (P＜0.05). Conclusion Sevoflurane can promote prolifer⁃ation and invasion in PC3 cells, which are gradually increased with time and concentration of sevoflurane treatment. The mechanism may involve in the up-regulation of HIF-1α expression．

Key words:prostatic neoplasms; anesthesia, inhalation; ethers; cell proliferation; neoplasm invasiveness; sevoflurane; HIF-1α

中图分类号：R697+.3

文献标志码：A

DOI:10.11958/58038

基金项目：湖南省中医药科研计划项目（201250）；衡阳市科技计划项目（2012KJ46）

作者简介：王国武（1973），男，大学本科，主要从事临床麻醉方面研究