白芨内生细菌组成及多样性分析

陈泽斌 李冰 王定康 徐胜光 刘佳妮 余磊 张永福 任禛 靳松

摘要：【目的】调查白芨内生细菌种类及多样性，为更好地保护和开发利用白芨资源提供科学依据。【方法】应用Illumina MiSeq高通量测序技术测定白芨内生细菌的16S rDNA-V4变异区序列，应用Qiime和Mothur等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元（OTUs）数量，分析物种丰度及分布的差异。【结果】获得用于分析的有效序列和OTU数为49550/48；稀释曲线表明测序深度充分，OTU的数量接近于饱和。白芨内生细菌主要分布于鞘脂单胞菌属（Sphingomonas，32.26%）、地杆菌属（Pedobacter，16.13%）、盐单胞菌属（Halomonas，16.13%）、土壤杆菌属（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter属（6.45%）、希瓦氏菌属（Shewanella， 6.45%）、假单胞菌属（Pseudomonas，6.45%）和短波单胞菌属（Brevundimonas，3.23%）8个属。【结论】鞘脂单胞菌属、地杆菌属、盐单胞菌属和土壤杆菌属是白芨内生细菌的优势种群。Illumina MiSeq高通量测序技术能准确反映植物内生微生物的种类组成和真实比例，在植物内生微生物研究中具有明显的优势和可行性。

关键词： 高通量测序；白芨；内生细菌；多样性

中图分类号： Q939.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0227-07

0 引言

【研究意义】白芨（Bletilla striata）又名连及草、甘根、白给、箬兰、朱兰、紫兰、紫蕙、百笠，为多年生草本球根植物（块根），株高18～60 cm，主要分布于我国、日本及缅甸北部（赵杰和毛晓健，2008）。白芨具有广泛的药用价值和园林价值，药用主要用于收敛止血、消肿生肌（和志娇等，2008）。白芨的种子自然萌发率极低，繁殖困难，野生资源稀少，由于需求量大，野生资源已濒临枯竭，现已列入《濒危动植物种国际贸易公约》予以保护（林福林等，2013）。内生菌是指其生活史中的某一段时期生活在健康植物组织内部，不引起植物组织明显侵染及症状改变的一类菌（Schulz et al.，2006）。关于植物内生细菌，现已从多种健康植物的根、茎、叶、果实和种子中分离出包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌共计达219种（隶属于71个属）植物内生细菌（Schulz et al.，2006）。目前比较系统研究的植物有棉花、小麦、水稻和花生（胡桂萍等，2010），发现优势种类主要分布于假单胞属（Pseudommonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）和土壤杆菌属（Agrobacterium）4个属，且尚未发现不存在内生细菌的植物种类或器官（徐亚军，2011）。已有研究表明，内生细菌在植物种子萌发（候晓强和郭顺星，2014）、抵御病原菌侵染（何劲等，2014）、促进幼苗生长中起着重要作用（徐文婷等，2014），同时内生细菌也是生物活性物质筛选的重要来源（童文君等，2014）。研究植物内生细菌多样性，对揭示植物内生细菌的相互作用机制，有效利用内生细菌资源具有重要意义。白芨是温带地生兰科植物中最具经济价值的类群之一，因此有必要对白芨内生细菌的种类组成进行研究。【前人研究进展】近年来，植物内生菌作为生物活性物质筛选的重要来源已引起人们的广泛关注（郭良栋，2001；任爱梅等，2010；Sun and Guo，2012）。在药用植物内生真菌研究方面，自Stierle等（1993）从短叶红豆杉的树皮中分离得到一株能产紫杉醇的内生真菌以来，药用植物内生真菌成为研究热点（杨显志等，2003；樊有赋等，2008；杜少康等，2009），研究发现药用植物内生真菌多以双核菌门子囊菌亚门中的核菌纲、盘菌纲和腔菌纲及其无性态型组成，也包括一些担子菌和接合菌（Petrini et al.，1991；Sinclair and Cerkauskas，1996）。在药用植物内生细菌研究方面，发现药用植物内生细菌优势类群多为芽孢杆菌属细菌。魏娟等（2015）对云南重楼的内生细菌分别进行分离鉴定，发现芽孢杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属是其优势内生细菌群；童文君等（2014）对美花石斛内生细菌进行分离鉴定，发现芽孢杆菌属、微杆菌属和肠杆菌属为优势属；杨梦莉等（2014）对岩白菜中内生细菌进行分离鉴定，发现芽孢杆菌属和假单孢属为其优势属；李淑彬等（2015）对高良姜内生细菌进行分离鉴定，发现芽孢杆菌、甲基杆菌分别为其最、次优势种群；杜晓宁等（2015）对宁夏枸杞中内生细菌进行分离鉴定，发现芽孢杆菌属为枸杞优势内生菌群。但是现有研究表明，分离培养方法分析的细菌仅限于那些能够在人工培养基上生长的细菌，这些可培养细菌仅占环境生物总数的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），因此有必要采用非培养方法对植物内生细菌种类组成进行研究。【本研究切入点】目前关于白芨的研究主要集中在人工繁殖、化学成分分析和药理作用等方面（刘莹等，2008；袁宁等，2009；孙达锋等，2009），有关白芨内生细菌多样性的研究未见报道。【拟解决的关键问题】采用近年来新兴起的个人型高通量DNA测序系统（Illumina MiSeq）对白芨内生细菌种类组成进行研究，以检测采用传统纯培养和非培养技术未能发现的低丰度植物内生细菌种类，探究白芨内生细菌种类多样性，为更好地保护和开发利用白芨资源提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2014年8月于云南盛南白芨种植基地采集20株无明显病害的白芨，取白芨假鳞茎块根部分为分析样品，均匀混合后放入无菌样品袋中，低温保鲜，于24 h内进行表面消毒處理，样品名为BJ。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 表面消毒 将新鲜白芨假鳞茎块根部分用自来水冲洗干净，再用75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分。表面消毒效果检验参照陈泽斌等（2014）的方法。

1. 2. 2 总DNA提取 按陈泽斌等（2012）的方法提取白芨假鳞茎块根总DNA，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检查DNA的纯度和浓度。取适量样品于离心管中，用无菌水稀释样品至1 ng/μL。

1. 2. 3 16S rDNA-V4区的PCR扩增 以稀释后的基因组DNA为模板，用带Barcode的16S rDNA-V4区特异引物515F（5'-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGT

AA-3'）和806R（5'-AGTTCCGGACTACHVGGGTWTC

TAAT-3'），使用高效和高保真酶（New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）进行PCR，确保扩增效率和准确性。

1. 2. 4 PCR产物的混样和纯化 PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用Thermo Scientific公司的Gene JET胶回收试剂盒切胶回收产物。

1. 2. 5 文库构建和上机测序 用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经Qubit和QPCR定量，文库合格后，使用Miseq进行上机测序（Youssef et al.，2009；Caporaso et al.，2011；Hess et al.，2011；Luo et al.，2012）。测序委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1. 3 生物信息学分析

测序得到的原始数据存在一定比例的干扰数据，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据经过拼接、过滤、去嵌合体后得到有效数据（Edgar et al.，2011），剔除宿主叶绿体和线粒体序列，然后对有效数据在97%水平上进行OUT聚类，并利用Greengene数据库进行物种注释（Edgar，2013）。通过对OTUs进行丰度、Alpha多样性及物种在各分类水平上的群落结果统计分析，可以得到微生物群落组成（Wang et al.，2007）；再通过Beta多样性分析，研究环境样本间的微生物群落结构差异（DeSantis et al.，2006）。

1. 4 数据分析

利用Uparse（version 7.1 http：//qiime.org/）软件平台进行OTU聚类，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各水平上统计每个样品的群落组成；利用Mothur软件进行稀释曲线分析；分别利用香农指数（Shannon）、辛普森指数（Simpson）和物种丰富度指数（ACE）公式计算细菌生态多样性指数；利用Fasttree软件+R语言制作热图；利用诺禾致源自主开发的SVG软件制作特定物种分类树图。

2 结果与分析

2. 1 序列长度分布

白芨样品所测得的49580条PE Reads长度分布在191～351 bp范围内，其中以长度为251 bp的序列最多，有48987条（图1）。从序列长度的分布来看，与16S rDNA-V4区序列长度大致吻合。

2. 2 样品复杂度分析

从稀释曲线（图2）可以看出，随着测序数量的增加，稀释曲线斜率逐渐降低，趋向平坦但未进入平台期，说明再增加测序数量也只会产生少量新的OTUs；从Chao1指数曲线（图3）可以看出，Chao1指数在0～5000的测序数量范围内增幅最大，在5000以后曲线斜率下降；从Shannon指数曲线（图4）可以看出，Shannon指数在0～5000的测序数量范围内增幅最大，在5000以后曲线斜率下降。3条多样性指数曲线在测序数量超过一定数量后均趋于平缓，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。

2. 3 OTUs数目统计及物种注释分析

白芨样品共获得49550条Tags（过滤后得到的拼接序列数），可分为48个OTUs（97%的序列相似性，下同），包括941条低频Tags和48609条可以获得注释的Tags（图5）。图6为白芨样品中相对丰度排名前8个属细菌所对应的OTUs的系统发生关系数据，表明白芨内生细菌主要分布于8个属：地杆菌属（Pedobacter）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、Kaistobacter属、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、希瓦氏菌属（Shewanella）、盐单胞菌属（Halomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas）。从OTUs丰度聚类图（图7）可以看出，在属的分类水平上相对丰度由大到小依次为：鞘脂单胞菌属>地杆菌属=盐单胞菌属>土壤杆菌属>Kaistobacter属=希瓦氏菌属=假单胞菌属>短波单胞菌属。

2. 4 多样品中特定物种分类树

从门的分类水平来看，白芨内生细菌分布在拟杆菌门（Bacteroidetes，16.13%）和变形菌门（Proteobacteria，83.87%）；从纲的分类水平来看，白芨内生细菌在Sphingobacteriia纲（16.13%）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria，54.84%）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria，29.03%）中均有分布；从目的分类水平来看，白芨内生细菌在鞘脂杆菌目（Sphingobacteriales，16.13%）、柄杆菌目（Caulobacterales，3.23%）、根瘤菌目（Rhizobiales，12.90%）、根瘤菌目（Sphingomonadales，38.71%）、交替单胞菌目（Alteromonadales，6.45%）、海洋螺菌目（Oceanospirillales，16.13%）和假单胞菌目（Pseudomonadales，6.45%）中均有分布；从科的分类水平来看，白芨内生细菌在鞘脂杆菌科（Sphingobacteriaceae，16.13%）、柄杆菌科（Caulobacteraceae，12.90%）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae，38.71%）、希万氏菌科（Shewanellaceae，6.45%）、盐单胞菌科（Halomonadaceae，16.13%）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae，6.45%）中均有分布；从属的分类水平来看，白芨内生细菌在地杆菌属（Pedobacter，16.13%）、短波单胞菌属（Brevundimonas，3.23%）、土壤杆菌属（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter屬（6.45%）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas，32.26%）、希瓦氏菌属（Shewanella， 6.45%）、盐单胞菌属（Halomonas，16.13%）和假单胞菌属（Pseudomonas，6.45%）中均有分布（图8）。由此可见，鞘脂单胞菌属、地杆菌属、盐单胞菌属和土壤杆菌属为白芨内生细菌的优势种群。

3 讨论

16S rRNA基因很早就应用于微生物种类鉴定，但利用高通量测序进行16S rRNA分析最早出现在2006年，如Sogin等（2006）应用该技术对深海微生物群落进行了分析，随后该技术在肠道微生物领域得到广泛应用（南春燕等，2013），但将该技术应用于植物内生微生物的研究未见报道。本研究首次将近几年迅速发展并成为主流的Illumina MiSeq高通量测序技术应用于植物内生细菌研究，克服了传统分子生物学方法通量低的缺陷，从基因组的水平上解析微生物群落结构，突破了很多厌氧内生微生物不能被分离培养的技术瓶颈（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999）。16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，包括 10个保守区域和9个高变区域，其中保守区在细菌间差异不明显，高变区具有属或种的特异性，随亲缘关系不同有一定的差异，因此，16S rDNA作为揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。16S rDNA扩增子测序，通常是选择某个或某几个变异区域，利用保守区设计通用引物进行PCR扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定，成为研究环境样品中微生物组成结构的重要手段。但就植物组织而言，叶绿体和线粒体与细菌在系统发育上具有高度的同源性（胡楷和吴庆书，2002），在对白芨内生细菌的16S rDNA-V4变异区序列进行Illumina MiSeq高通量测序后，确实发现部分序列归属于宿主叶绿体和线粒体，存在一定比例的宿主污染现象，为了使细菌多样性的分析结果更加准确、可靠，本研究剔除了宿主叶绿体和线粒体序列。为避开线粒体和叶绿体的干扰，下一步应在不同高通量测序平台上针对16S rDNA的9个高变区的选择及组合做更多尝试，评估样本的复杂程度及宿主的污染情況，选择合理的测序区域或设计特异性更高的引物，制定更好的测序策略，从而将高通量测序技术更好地应用于植物内生细菌研究。

目前关于白芨内生细菌多样性的研究尚无报道，但通过传统的分离培养方法发现其他植物内生细菌的优势类群均为芽孢杆菌属（Bacillus）细菌（丁雅迪等，2015），与本研究结果不一致。这也从侧面反映出植物内生细菌中未培养微生物占很大比例，培养方法分析的细菌仅限于那些能够在人工培养基上生长的细菌，一些适合于分离培养基营养条件的菌株在分离过程中大量富集，而不适合于分离培养基营养条件的菌株在分离过程中逐渐衰退。许多研究已经证实，通过传统的分离培养方法鉴定的微生物仅占环境生物总数的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），说明通过传统培养方法得到的结果并不能真实反映内生细菌的多样性。因此，采用高通量测序的研究方法与传统的分离培养方法相比，发现的内生细菌种类不但丰富度可能有差别，而且优势种群也可能不同。已有研究表明，鞘脂单胞菌属细菌能够利用的底物广泛，从多环芳烃类化合物、聚乙烯醇等高聚物到简单无机物N2+均能利用，某些种属还能产生有价值的生物高分子（如β-胡萝卜素、结冷胶）（胡杰等，2007），说明白芨内生细菌可为复杂有机物的降解提供良好的微生物来源。至今，关于盐单胞菌属和短波单胞菌属细菌功能、代谢的研究未见报道，其作为内生细菌的主要类群尚属首次报道。

尽管高通量测序技术可以克服不可培养的困难，但是该技术也存在弊端，由于测序读长相比Sanger一代测序短得多，再加上用于序列比对的数据库目前还不够完善，使得多数序列均无法被注释到种的水平，因此，快速、准确及全面的植物内生微生物多样性研究仍需要多种方法结合来完成。

4 结论

白芨内生细菌主要由地杆菌属、短波单胞菌属、土壤杆菌属、Kaistobacter属、鞘脂单胞菌属、希瓦氏菌属、盐单胞菌属和假单胞菌属等8个属组成，其中，鞘脂单胞菌属、地杆菌属、盐单胞菌属和土壤杆菌属为优势种群。采用llumina MiSeq高通量测序技术可以检测到采用传统纯培养和非培养技术未能发现的低丰度植物内生细菌种类，能准确反映植物内生微生物的种类组成和真实比例，在植物内生微生物研究中具有的明显优势和可行性。

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（責任编辑 麻小燕）