一株蜡样芽胞杆菌B—21的发酵优化

闫洪雪 李丽 刘露 梁文辉 张鹏鹏 赵宏涛

摘要：对蜡样芽胞杆菌B-21的生长情况进行培养观测，通过最适温度及最适初始pH值的选择、碳氮源的单因素试验确定最适培养条件及最适碳氮源。采用正交试验的方法进一步确定各培养组分的最适配比，最终确定该菌培养基的有机组分最适用量为葡萄糖7g/L、玉米淀粉8g/L、豆饼粉6g/L，发酵菌数最高可达到120×10⁸cfu/mL。

关键词：蜡样芽胞杆菌；培养优化；单因素试验；正交试验

中图分类号：S182 文献标识号：A 文章编号：1001—4942（2016）03—0062—04

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种革兰氏阳性菌，能够形成芽胞，且芽胞有较强的抵御不良条件的抗性，能够适应各种不同的环境生长。大多数蜡样芽胞杆菌菌种与动植物有密切共生关系，且能够产生多种生物活性物质，如各种蛋白酶、淀粉酶、抗菌素、纤维素酶，因此被广泛应用于农业、饲料、食品、保健品等领域。近年研究发现，蜡样芽胞杆菌作为植物根际促生菌（PGPR）具有较强的生态适应能力，是土壤中的优势菌，它能够促进植物生长，且对多种植物病害有明显的抑制作用。

本试验中所提及的蜡样芽胞杆菌是从苹果根系土壤中筛选获得，经鉴定为益生菌，具有抑菌作用。通过对该菌株的发酵条件优化，提高其发酵活菌数，可进一步应用于工业生产，与本公司海藻肥料相结合，开发出抑菌促生的新型苹果肥料，进一步提高苹果的产量与质量。

1材料与方法

1.1菌种

本试验所用蜡样芽胞杆菌是从苹果根系土壤中筛选所得，为本实验室保存。

1.2仪器与试剂

超净工作台SW-CJ-2F（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、旋转式恒温摇床THZ-D（江苏太仓市实验设备厂）、涡旋振荡器（澳门市其林贝尔仪器制造有限公司）、恒温培养箱LRH-150B（韶关市泰宏医疗器械有限公司）、紫外可见分光光度计UV-5100-5800（上海精密仪器厂）。

所用试剂为蛋白胨、玉米粉、酵母粉、豆饼粉、葡萄糖、麦芽糊精、玉米淀粉、脱脂豆粉、蔗糖、牛肉粉、NaCl、KH₂PO₄、（NH₄）₂SO₄、CaCO₃、NaOH、HCl、pH试纸。

1.3生长曲线的测定

斜面活化的B-21菌株用LB液体培养基培养。B-21菌悬液的OD值反映其随着培养时间的菌数变化。在培养不同时间取样，检测菌悬液在波长为600 nm时的吸光度，绘制B-21菌株的生长曲线。

1.4培养条件优化

1.4.1培养温度的选择取1 mL对数期种子培养液接人50 mL灭菌前pH为7.0的LB液体培养基中，设置温度梯度为26、28、30、32、34、36℃，摇床振荡培养，转速180 r/min，培养至芽胞转化率95%以上停止培养，稀释涂布法测菌数。

1.4.2初始pH值的选择取1 mL对数期种子培养液接入50 mL灭菌前pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的液体LB培养基中，设置转速180 r/min，32℃摇床培养，至芽胞转化率95%以上，稀释涂布法测菌数。

1.5单因素试验

1.5.1最适碳源选择 分别以玉米粉、玉米淀粉、蔗糖和麦芽糊精作为长效碳源，用量为7g/L，其余成分为葡萄糖7g/L，豆饼粉6g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，碳酸钙1g/L配培养基。调节灭菌前培养基的pH值为7.5。接种B-21菌株后，32℃、180 r/min摇床振荡培养。镜检观察待芽胞转化率95%以上时，稀释涂布法计菌数。

1.5.2最适氮源选择 分别以豆饼粉、牛肉粉、脱脂豆粉和蛋白胨作为单因素改变氮源，用量为6g/L，其余成分为玉米淀粉7g/L，葡萄糖7g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，碳酸钙1g/L配培养基。调节灭菌前培养基的pH值为7.5。接种B-21菌株后，32℃、180 r/min摇床振荡培养。镜检观察，待芽胞转化率为95%以上时，稀释涂布法计菌数。

1.6最佳配比选择及验证

根据L₁₆（4⁵）正交表，以该表前三列为准，设计三因素四水平的正交试验。试验变量的三个因素分别为葡萄糖、玉米淀粉、豆饼粉，对应的四个水平分别是4、5、6、7g/L；5、6、7、8g/L；4、6、8、10g/L。其他成分为硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，碳酸钙1g/L。调节灭菌前培养基pH值为7.5。

将B-21蜡样芽胞杆菌分别接种到16瓶培养基中，32℃、180 r/min摇床振荡培养。镜检观察，待芽胞转化率95%以上时，稀释涂布法计菌数。

对试验结果进行分析，根据正交试验分析得出最佳配比后，再根据该组合各成分的配比配制培养基，调节灭菌前培养基pH值为7.5，32℃、180 r/min摇床振荡培养该菌株，待芽胞转化率95%以上时，稀释涂布法计菌数，以验证最优组合的可靠性。

1.7数据分析

用Microsoft Excel 2003分别统计发酵培养后的活菌数，制作图表，得到该菌株的生长曲线、最适培养条件及最适培养基成分及配比。

2结果与分析

2.1 B-21的生长曲线

在不同时间取样后，测得600 nm波长下B-21菌液的吸光度值，结果表明，用LB培养，B-21在培养3～16 h处于对数生长期，16 h的OD值超过1.5，在20～24 h达到最高峰，之后处于缓慢下降趋势（图1）。

2.2最适培养温度

用LB培养基培养B-21菌株，培养温度分别为26、28、30、32、34、36℃，发酵结束后计数结果表明，该菌的最适培养温度是32℃（图2）。

2.3灭菌前最适pH值

32℃条件下，用LB培养基培养B-21菌株，在不同初始pH值培养基培养后的计数结果如图3所示。结果显示该菌培养的灭菌前最适pH值为7.5。

2.4最适碳源

通过用不同碳源的培养基培养，发酵后计数结果如图4所示。从图中可以看出，使用玉米淀粉做碳源的处理B-21菌数最多，数量达到78×10⁸cfu/mL以上，因此培养该菌的最适碳源为玉米淀粉。

2.5最适氮源

确定最适碳源后，单因素改变氮源，发酵结束后，统计的菌数结果（图5）显示，培养B-21的最佳氮源为豆饼粉。试验过程中脱脂豆粉菌数也较高，但重复试验不稳定，故选择豆饼粉作为最佳氮源。

2.6正交试验结果

在单因素试验确定最适碳源、氮源后，为进一步优化培养基，采用正交试验的方法对培养基的有机组分进行试验，寻找最佳配比。统计的菌数结果如表1所示。

从表1中可看出，B-21的最佳培养基有机组分为葡萄糖7g/L，玉米淀粉8g/L，豆饼粉6g/L。极差分析可知，各因子对活菌数影响的大小为葡萄糖>玉米淀粉>豆饼粉。

进一步进行验证试验，以最佳处理组合的培养基发酵培养B-21菌株，菌量达120×10⁸cfu/mL，表明培养基有机组分为葡萄糖7g/L、玉米淀粉8g/L、豆饼粉6g/L即为本试验的最佳处理组合。

3结论与讨论

蜡样芽胞杆菌近年来广泛应用于动物饲料、食品与保健、植物肥料等的生产，具有促生与抑菌的作用。本研究通过观察一株蜡样芽胞杆菌B-21的生长情况，通过一系列试验，确定了其最佳培养温度为32℃，最适初始pH值为7.5，最佳碳源为玉米淀粉，最佳氮源为豆饼粉。并通过正交试验的进一步优化培养，确定了高产的培养基成分及最佳碳氮源配比，可使发酵菌数最高达到120×10⁸cfu/mL，为之后用于工业发酵生产提供了良好依据，为与本公司海藻肥料相结合，开发新型肥料奠定了基础。