乙烯利对橡胶树乳管伤口堵塞相关蛋白基因表达和含量的影响

王冬冬　史敏晶　杨署光　田维敏

摘 要 乳管伤口堵塞物的形成决定着排胶时间的长短，乙烯利刺激能显著延长排胶时间，但目前关于乙烯利刺激对乳管堵塞物的影响研究很少。以橡胶树无性系PR107为材料，利用荧光定量PCR和蛋白质Western-blot研究了乙烯利刺激对黄色体内含物相关蛋白的基因表达以及蛋白（包括黄色体和C-乳清中）的含量变化的影响，同时利用光学显微技术研究了割口表面蛋白质网形成的情况。结果表明：乙烯利刺激后PR107胶乳中HGN 1、Hevamine A及HEV 1这3个基因的相对表达量均显著性降低；黄色体中和C-乳清中对应的β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶以及橡胶素蛋白含量也显著性降低；而割口处割面形成的蛋白质网明显多于对照橡胶树，且随着排胶时间的延长蛋白质积累增多。

关键词 巴西橡胶树；乙烯利；黄色体；基因表达；乳管堵塞

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Duration of latex flow after tapping is mainly determined by the formation of plug materials at the end of laticifer cut. Ethrel is the most effective stimuli in prolonging the latex flow， but the effect of ethrel on the plugging formation is still not well known. By using fluorescent quantitative PCR， protein western-blot， and light microscopy， the effects of ethrel on the gene expression and content of plugging-related proteins as well as the formation of protein-network on the tapping panel in rubber tree clones PR107 were studied. The results showed that， after stimulation of ethrel， the relative expression level of gene Hevamine A， HGN 1 and HEV 1 in latex all significantly dropped； correspondingly， the content of β-1， 3-glucanase， chitinase and hevein protein in lutoids and C-serum also reduced. Conversely， the protein-network on the tapping panel accumulated more obviously than the control and increased accompany with the latex flow.

Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.； Ethrel； Lutoid； Gene expression； Laticifer plug

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.012

橡膠树（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）排胶时间是决定胶乳产量的三个关键性因素之一，Boatman等[1]发现乳管伤口会形成堵塞物，堵塞物形成后降低排胶速度从而影响着排胶时间的长短。乙烯利刺激显著延长排胶时间[2]，但其延长排胶时间的机制尚不清楚。Gomez[3]认为乙烯利刺激能降低橡胶粒子的絮凝活性，延缓橡胶粒子凝集，从而延长胶乳排胶时间；安峰等[4]研究发现乙烯利刺激能增加橡胶树胶乳中的水通道蛋白基因HbPIP2；3表达量，并认为HbPIP2；3对乳管中的水平衡起着监管作用；Tungngoen等[5]研究认为乙烯利刺激能够使橡胶树水通道蛋白大量表达，通过增加乳管细胞含水量稀释胶乳提高了乳管膨压，从而加快排胶初速度；然而范思伟等[6]指出乙烯利刺激并不能提高胶乳排胶初速度，史敏晶等[7]进一步证明了乙烯利刺激降低胶乳排胶初速度。乙烯利对乳管的影响复杂而广泛，需要从不同的角度去研究。黄色体在乳管堵塞中的作用一直是人们研究的重点，国外学者普遍认为黄色体破裂导致的胶乳凝固是堵塞的原因[8-10]；而郝秉中等[11-12]，在乳管伤口末端发现了“蛋白质网”，并认为蛋白质网在乳管伤口堵塞中起到关键性作用[13]；史敏晶等[14]利用间接免疫荧光定位及激光共聚焦显微镜技术鉴定了蛋白质网的主要成分为来自黄色体中的β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶以及橡胶素。这3种蛋白质不仅是“蛋白质网”的主要组成成分，而且还对橡胶粒子凝集起着重要的作用[15-16]。

为了探明乙烯利刺激后对橡胶树乳管中这些堵塞相关的黄色体蛋白有何影响，本文从基因表达以及蛋白质含量变化等方面展开了研究，旨在为进一步阐述乙烯利延长排胶机制和橡胶树乳管堵塞机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用树 选用1997年定植在中国热带农业科学院试验场二队的PR107无性系的橡胶树6株，采用3天1刀，1/2茎围（1/2S d/3）割胶制度。分别选取3株橡胶树用2%乙烯利刺激和不处理，乙烯利刺激后48 h割胶。割胶后待胶线杂质流尽，用1.5 mL离心管收集干净胶乳并迅速放入液氮中用于总RNA提取。

选取乙烯利刺激和未刺激的PR107橡胶树3株，分别在割胶后5 min、刚停排及停排后（割面胶线凝固）3个时间段取材，即以打孔器在割面处取树皮，注意保留割口上的胶线；远离割口的健康树皮作为对照。

1.1.2 试剂、材料和仪器 Tricine、Tris碱、十二烷基磺酸钠（SDS）由生工生物工程（上海）有限公司生产；明胶为BBI公司生产；环保封片胶为上海宏兹实业有限公司生产；固绿、切片石蜡、N-N′双丙烯酰胺、戊二醛、过硫酸铵（AP）、高碘酸钾为国药集团化学试剂有限公司产品；无水乙醇、正丁醇、碘、二甲苯、冰醋酸、氯化钠、甲醇、醋酸钠为广州化学试剂厂产品；BCIP/NBT底物显色剂为AMRESCO生产；PVDF膜（0.2 μm）为Millipore生产；碱性磷酸酶标记的兔抗鸡、羊抗兔和羊抗鼠二抗为PIERCE生产；SYBR Premix Ex Taq II、EASY Dilution为TaKaRa产品。

Optima L-100XP型超高速离心机为美国Beckman生产；DY-12C型电泳仪，转印槽为北京六一仪器厂生产；NANODROP 2000分光光度仪为美国Thermo生产；Bio-Rad ChemiDocTM MP凝胶成像系统为美国Bio-Rad生产；CFX-384实时荧光定量仪为Bio-Rad生产；LECICA RM2235型石蜡切片机为德国Leica生产。

1.2 方法

1.2.1 胶乳总RNA提取及cDNA合成 橡胶树胶乳总RNA提取使用天根公司生产的植物总RNA提取试剂盒，详细操作参考说明书。检测总RNA纯度、浓度及完整性。按照Thermo公司生产的cDNA反转录试剂盒，用胶乳总RNA合成的cDNA第一链，反应体系：①：Oligo（dT）18 primer 0.5 μL，Random Hexamer primer 1 μL，胶乳总RNA 1 μg，加Water （nuclease-free）到12 μL，PCR仪中65 ℃反应5 min，冰上放置；②：5×Reaction Buffer 4 μL，dNTPs Mix（10 mmol/L）2 μL，RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL，RevertAid M-MuLV RT（200 U/μL）1 μL，与反应后溶液混合，42 ℃反应60 min，70 ℃加热5 min。

1.2.2 引物设计及合成 根据巴西橡胶树β-1，3-葡聚糖酶（HGN 1）、几丁质酶（Hevamine A）及橡胶素（HEV 1）的基因序列设计引物，序列依次为HGN1-F：5′-CTCCAAAGCCTTACCAATCCT-3′，HGN1-R：5′-ACATCATCCCTGAA AGCACCT-3′；Hevamine A-F：5′-CTTCTTCCCGTCCCTTAG-3′，Hevamine A-R：5′-CCTTCTTGCCTTGCTTGC-3′；HEV1-F：TCATGGCGGAGCAAGTATGGC，HEV1-R：CACACTCAAGCACTTTCCACAGG；内参基因引物为HbUbi-F：5′-GGTTCTGAGGCTTCGTGG-3′和HbUbi-R：5′-CATCCTCTAATTGCTTCCCT-3′，引物由立菲生物技术有限公司合成。

1.2.3 荧光定量PCR 参照吴绍华等[17]方法。

1.2.4 Tricine-SDS-PAGE C-乳清采用等体积上样，上样量为10 μL。黄色体样品采用等量上样，称取0.1 g黄色体，加入80 μL ddH2O和80 μL 2×上样缓冲液，混匀后于PCR仪中95 ℃变性20 min，12 000 r/min离心10 min，取10 μL用于SDS-PAGE和Western-blot[18]。分离胶浓度为14%。浓缩胶电压为40 V，分离胶电压设为100 V至电泳结束。

1.2.5 Western-blot 将SDS-PAGE电泳后凝胶上的蛋白質转移到PVDF膜上，每张膜电流30 mA转移100 min。半干碳板电极缓冲含48 mmol/L Tris碱，39 mmol/L甘氨酸，1.3 mmol/L SDS，20%（V/V）甲醇[19]。一抗和二抗均在室温孵育2～3 h，BCIP/NBT显色1 min，利用Bio-Rad ChemiDocTM MP凝胶成像系统成像，并利用Image Lab 5.1软件定量分析PVDF膜上蛋白质条带的强度。

1.2.6 石蜡切片的制备以及汞溴酚蓝染色 参照邓顺楠[20]文中方法制备石蜡切片，汞溴酚蓝染色，显微镜观察乳管伤口处蛋白质积累情况。

2 结果与分析

2.1 乙烯利处理对排胶时间的影响

割胶后记录排胶时间，以每20 s 1滴为排胶停止。结果表明，使用乙烯利刺激后排胶时间平均为265.0 min，非乙烯利刺激排胶时间平均为165.5 min，可见乙烯利刺激能极显著（p<0.01）延长排胶时间（图1）。

2.2 Hevamine A、HGN 1及HEV 1在胶乳中的表达

以泛素HbUbi基因为内参，通过荧光定量PCR技术，分析乙烯利刺激前后胶乳中Hevamine A（几丁质酶）、HGN 1（β-1，3-葡聚糖酶）及HEV 1（橡胶素）的表达情况。结果表明（图2），乙烯利刺激后胶乳中的Hevamine A、HGN 1表达量极显著性下调（p<0.01），HEV 1表达量显著性下调（p<0.05）。

2.3 黄色体内含物蛋白质组分分析

SDS-PAGE结果表明，乙烯利刺激后黄色体的蛋白质整体水平下降（图3-A），尤其是分子量35 ku、25 ku以及10 ku左右的蛋白带明显变弱，表明乙烯利刺激后这3种蛋白的含量明显低于对照。利用β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶及橡胶素3种蛋白的抗体进行免疫印迹分析，结果发现35 ku、25 ku以及10 ku蛋白带分别对应的是β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶和橡胶素（图3-B，C，D），与橡胶素抗体发生免疫反应的还有分子量约20 ku的橡胶素前体。由于橡胶素的分子量较小，转移效率高，在保证大分子量蛋白获得良好转移情况下，可能存在透膜现象，所以该蛋白出现了免疫条带较弱的结果，但是其变化规律与电泳结果基本保持一致。对PVDF膜上的免疫印迹蛋白条带进行定量分析（图3-E，F，G）结果表明，乙烯利刺激后β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶和橡胶素3种蛋白的含量均显著性（p<0.05）降低。可见，这些蛋白含量的变化与基因表达的变化规律一致。

2.4 C-乳清蛋白质分析

SDS-PAGE结果表明（图4-A），乙烯利刺激后C-乳清中的蛋白也发生了变化。Western-blot结果表明，C-乳清中β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶和橡胶素3种蛋白质在乙烯利刺激后发生明显变化（图4- B，C，D），其中，分子量为25 ku的几丁质酶和分子量约10 ku橡胶素的含量降低，而β-1，3-葡聚糖酶在含量以及蛋白带型上都发生了变化。定量分析结果表明（图4-E，F，G），乙烯利刺激后C-乳清中的几丁质酶含量和橡胶素含量极显著性（p<0.01）降低；β-1，3-葡聚糖酶总含量变化未达到显著性差异，但其中分子量较高的蛋白带含量显著性降低，分子量较低的含量变化不明显。

2.5 乙烯利对乳管伤口割面蛋白质网积累的影响

利用汞-溴酚蓝染色观察割口处蛋白质网积累情况。结果表明，远离割口处的健康树皮中染色浅，表明乳管中未出现蛋白质的积累（图5-A）；与非刺激割胶树相比，乙烯利刺激的胶树割胶后5 min（图5-B，E）乳管伤口表面被染成蓝色的蛋白质网形成多；刚停排时割面蛋白质网进一步增多（图5-C，F）；完全停止排胶后（图5-D，G）乳管伤口表面蛋白质网形成多且致密。可见，橡胶树乳管伤口表面蛋白质网随着排胶时间的延长而增多，而乙烯利处理增加了这一蛋白质网的积累。

3 讨论与结论

乳管伤口堵塞物的性质国内外学者持有不同的观点，但其中都强调了黄色体的重要性[16，21，22]。黄色体是橡胶树乳管中特有的细胞器，几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡胶素是组成黄色体内含物蛋白的主要成分[15，23]，大量研究表明，这3种蛋白质在橡胶树乳管堵塞中起着重要作用[14，16，24]。最近研究还表明，黄色体破裂后的黄色体膜碎片也参与了乳管伤口处堵塞物的形成[9-10，25]。乙烯利是当前最有效的排胶调节刺激剂，能够显著延长排胶时间。研究乙烯利刺激对黄色体内含物蛋白的影响对阐明乳管堵塞机制具有重要价值。

笔者研究发现乙烯利刺激后胶乳中基因Hevamine A、HGN 1及HEV 1表达量均显著下调，而黄瑾等[26]认为乙烯利能够诱导几丁质酶基因的表达，并且不同品种或不同处理对几丁质酶的表达量影响较大。本研究与黄瑾等的结果不同可能与使用的品系以及对材料的处理不同有关。利用Western-blot技术检测黄色体内含物蛋白组分，发现几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡胶素含量均显著性减少，与对应的基因之间呈正相关。另外，C-乳清中的几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡胶素蛋白质含量也明显降低，而这些蛋白来自于破裂的黄色体，其含量降低的原因可能与其本身表达量降低有关，还可能与黄色体破裂程度以及蛋白质被截留在乳管伤口末端和割线表面的多少有关。我们通过汞-溴酚蓝染色发现乙烯利刺激明显增加排胶过程中割面蛋白质网的积累，由于蛋白质网主要是由黄色体中的几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡胶素组成[13]。由此推测，几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡胶素在 C-乳清中含量减少的主要原因之一是被大量截留在伤口末端和割线表面。乙烯利刺激降低乳管的排胶初速度[5-6]，也应与这些蛋白质网堵塞物的大量形成有关。大量研究表明，几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡胶素是重要的防御性蛋白[27-29]，这些蛋白的积累对受伤的割口明显的起到抗菌、保护的作用。乙烯利能提高对条溃疡等病害的抗性[30-31]，推测与蛋白质网在割口大量的积累有关。

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