外源IBA对裸花紫珠扦插生根和内源激素含量变化的影响

周再知　刘式超　张金浩　梁坤南　马华明　黄桂华

摘 要 以药用植物裸花紫珠（Callicarpa nudiflora）1年生半木质化枝条为材料，采用吲哚丁酸（IBA）5个浓度（0、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L）处理。每隔6 d从1 500 mg/L IBA浓度与对照处理插穗的基部取样1次，测定在生根过程中内源吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）含量的变化。扦插80 d后，采用隶属函数法综合评价生根效果。结果表明：不同IBA浓度处理对插穗生根影响差异显著。与对照相比，IBA处理不同程度地提高了插穗的生根率、平均生根数、最长根长和平均根长，降低了偏根率。其中，以1 500 mg/L IBA处理生根效果最好，其生根率、根体积最大，综合评价指数最高。在裸花紫珠插穗根原基诱导和愈伤组织形成阶段，1 500 mg/L IBA处理可提高插穗基部IAA和GA3含量，降低ABA和ZR含量，IAA/ABA和IAA/ZR比值迅速升高。在不定根形成、发生及生长发育阶段，IAA含量下降，IAA/ABA和IAA/ZR比值逐渐降低。较低的内源ABA、ZR含量和较高的IAA、GA3含量及IAA/ABA、IAA/ZR比值，有利于裸花紫珠插穗半木质化插穗不定根的形成和发育。

关键词 插条；不定根发育；植物生长调节剂；内源激素

中图分类号 S567.19 文献标识码 A

Abstract The semi-wooden shoot cuttings of a medicinal plant Callicarpa nudiflora were collected and treated with indole-3-butyric acid（IBA）（concentrations0， 1 000， 1 500， 2 000 and 2 500 mg/L）The endogenous hormones（IAA， ABA， GA3，ZR）contents of cuttings of 1 500 mg/L IBA treatment were detected every 6 days interval. Rooting responses were measured and assessed by using a comprehensive assessment index after 80 days in the greenhouse. The significant difference was found among the five treatments. IBA treatments（1 000， 1 500， 2 000 and 2 500 mg/L）increased rooting rate， average root number， the largest and average root length， root volume and decreased hyponastic root rate significantly. The maximum rooting rate， root volume， and the highest comprehensive evaluation index of rooting capacity were obtained in the treatment of 1 500 mg/L IBA treatment. In the phase of root primordium inducement and formation of callus， 1 500 mg/L IBA treatment increased the content of endogenous IAA and GA3 content of cuttings， inhabited the ABA and ZR activity， correspondingly increasing of the value of IAA/ABA and IAA/ZR. The content of endogenous IAA， and the value of IAA/ABA and IAA/ZR were gradually decreased when the adventitious root went to the period of formation and development phase treated by 1 500 mg/L IBA. The results demonstrated that the lower content of endogenous ABA and ZR， the higher content of IAA， GA3 and the rate of IAA/ABA and IAA/ZR， were beneficial to the formation and development of adventitious roots of semi-wooden shoot cuttings of C. nudiflora.

Key words Shoot cuttings； Rooting； Plant growth regulator； Endogenous hormones

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.004

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）為马鞭草科（Verbenaceae）紫珠属（Callicarpa）植物，灌木至小乔木。主要分布于中国的海南、广东、广西、云南等地，以及印度、越南、马来西亚和澳大利亚北部，少数分布于美洲的热带地区[1]。裸花紫珠全株可入药，为海南省大宗性地道药材，同时也是海南黎族常用的药材[2-3]，具有抗菌止血，解毒消炎，驱风祛湿和抗肿瘤之功效，主治化脓性炎症，急性传染性肝炎，上呼吸道感染和呼吸道、消化道及外伤出血，外治烧、烫伤等[4-5]。以裸花紫珠为原料研制的裸花紫珠片、栓和胶囊等中成药远销香港、东南亚等地区[6-7]。近年来，随着裸花紫珠商业价值的日益凸显，对野生裸花紫珠的乱采滥挖日趋加剧，资源逐年减少。为了保护裸花紫珠的野生资源及促进其人工林的发展，开展无性繁殖特别是扦插繁殖技术[8]的研究具有重要现实意义。

自外源激素吲哚丁酸（IBA）被报道可促进植物不定根的形成，甚至比吲哚乙酸（IAA）更有效以来，IBA已广泛应用于植物扦插繁殖研究[9]。多数研究结果表明，经IBA处理的植物插穗，生根率高于未经处理的插穗[10-12]。在扦插不定根形成过程中，外源IBA影响内源激素浓度的变化[13]。经IBA处理的桃（Amygdalus persica）硬枝插条，扦插后4 d，插穗内源激素发生显著变化[14]。然而针对裸花紫珠，IBA对扦插生根及内源激素变化的影响，目前尚未见报道。笔者采用综合评价方法，确定了裸花紫珠扦插生根最适宜的外源IBA浓度，以及在該浓度下4种内源激素及其比值的动态变化规律，旨为探讨外源IBA对裸花紫珠扦插生根的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

从海南五指山采集野生裸花紫珠的种子，播种育苗。2年生时，选用生长健壮、无病虫害的当年生半木质化枝条。截取中部，制成长度9～11 cm，具2～3个芽眼，上端为平口、保留两侧半片叶，下端斜切接近马蹄形的插穗。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 采用单因素完全随机区组设计，设置5个IBA浓度（0、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L）处理， 每个区组重复3次，每处理小区插穗100条，共计1 500条。以泥炭 ∶ 蛭石 ∶ 河沙=2 ∶ 1 ∶ 1的体积比配置混合扦插基质。扦插前2 d，将其装入规格长×宽×深=540 mm×280 mm×110 mm的50穴苗盘内，并用0.5%的高锰酸钾进行淋灌消毒。将制备好的插穗每50条扎成1捆，用质量百分比为0.1%的高锰酸钾溶液消毒1～2 min，取出用蒸馏水冲洗干净。在IBA不同处理浓度溶液及清水中速蘸15 s，而后竖直插于上述穴盘中，深度3～4 cm。扦插后，浇水、覆盖薄膜，每隔3 d交替喷洒质量百分比为0.1%的高锰酸钾溶液和50%多菌灵可湿性粉剂500倍液消毒；20 d后，按此浓度交替消毒，7天1次。保持扦插环境温度在21～33 ℃，相对湿度在70%以上。

1.2.2 指标测定 扦插后，每隔2 d观察1次形态变化，记录生根进程。第80天时，调查插穗的生根数量、最大根长，统计生根率及偏根率（根基部一侧发出不定根的穗条数占全部生根穗条数的百分比）。从每个处理中随机选取10个插穗，用中晶i-800扫描根系，Rhizotron 2009软件计算不定根的平均根长、表面积、平均根径和体积。扦插后，每隔6 d，从1 500 mg/L IBA和对照处理中取样1次，共计8次。从每个重复中随机抽取10～12条插穗，迅速用蒸馏水将基部冲洗干净，滤纸擦干，然后置于冰盒内。在实验室内，迅速剥取穗条基部2～3 cm韧皮部，剪碎混匀，经液氮冷冻处理后，于-20 ℃的超低温冰箱中保存。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定内源激素吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）的含量（中国农业大学化控中心测定）。

1.3 数据分析

生根率和偏根率，按sin-1公式进行反正弦转换。使用SPSS软件（18.0）进行方差分析，Duncan多重比较。运用隶属函数法进行生根效果综合评价[15]，综合评价值指数（Comprehensive Assemant Index， CAI）为生根率、偏根率、平均生根数、最大根长、平均根长和根体积的隶属函数值之和。

2 结果与分析

2.1 生根进程形态观察

扦插后第6天，IBA处理插穗基部皮孔膨大外凸、呈开裂迹象（图1-A）。扦插第12天，穗条上部开始萌芽，基部切口附近皮部颜色变深、膨大开裂，切口下方出现白色絮状愈伤组织，不定根开始发生（图1-B）。扦插12～30 d，IBA处理插穗基部不定根从皮部或愈伤组织伸出，插穗上部新叶迅速生长（图1-C）。扦插30 d后，插穗生根和成活情况基本稳定，不定根生长加速（图1-D）。在整个生根进程中，对照组滞后。观察发现，裸花紫珠的扦插生根类型以皮部生根型为主，少数为愈伤诱导生根型。不定根的形成大致划分为3个阶段，第1阶段（0～12 d）为皮内根原基诱导分化、愈伤组织形成期阶段，第2阶段（12～30 d）为不定根形成及发生阶段，第3阶段（30 d以后）为不定根伸长及发育阶段。

2.2 IBA处理对裸花紫珠扦插生根效果的影响

不同IBA浓度处理下，插穗的生根率、偏根率、平均生根数、最长和平均根长以及根体积指标差异显著（p﹤0.05）。从表1看出，随IBA浓度的增加，插穗的生根率先随之升高，当IBA浓度为1 500 mg/L时，达最大值，而后随浓度的升高而降低。4个IBA浓度处理的生根率分别比对照（CK）提高15.1、21.7、9.5和4.1个百分点，偏根率下降了5.6、9.9、7.9和6.9百分点。尽管4个IBA浓度处理下的插穗的平均生根数差别不大，但均显著高于对照，其中2 000 mg/L IBA浓度处理的插穗生根数量最多，比对照多1.2条/穗。不同IBA浓度处理对裸花紫珠插穗根系的生长产生显著影响。随IBA浓度的升高，最长根的生长上升，1 500 mg/L IBA时达到最大值，而后随IBA浓度的升高，生长受到抑制；从平均根长和根体积指标看，1 500 mg/L IBA处理达最大值，分别比对照提高了13.7%和30.5%，当IBA浓度升到2 500 mg/L时，平均根长和根体积低于对照，尽管与对照的差异不显著。

从不同IBA处理插穗生根综合评价指数大小（表1）可以看出，综合评价指数随IBA浓度的升高而上升，当IBA为1 500 mg/L时，达最大值，而后随IBA浓度的升高逐渐下降。1 500 mg/L IBA和2 000 mg/L IBA处理的综合评价指数分别是对照的57和44倍。

2.3 IBA处理对插穗内源激素含量变化的影响

2.3.1 IAA含量的变化 图2-A表明，扦插后1 500 mg/L IBA处理插穗的IAA含量迅速上升，第6天时，达到峰值87.96 ng/（g FW），而对照处理插穗的IAA含量呈下降趋势。插后6～24 d，1 500 mg/L IBA处理插穗的IAA含量逐渐下降，对照处理插穗的则开始上升，第24天时升到峰值75.39 ng/（g FW）生根过程形态观察发现，1 500 mg/L IBA处理插穗基部皮孔膨大裂开，切口处出现少量愈伤组织，且有白色不定根露出，而对照处理的插穗则延迟6～8 d发生。扦插24 d后，不定根不断伸长，IBA 1 500及对照处理插穗的IAA含量均逐渐下降，但1 500 mg/L IBA处理下降的幅度大于对照。

2.3.2 ABA含量的变化 图2-B表明，扦插后1 500 mg/L IBA处理插穗的ABA含量缓慢降低，而对照处理插穗的ABA含量则呈现轻微上升趋势；第12天时，1 500 mg/L IBA处理插穗的ABA含量下降至92.70 ng/（g FW），对照处理则上升到峰值171.63 ng/（g FW）。1 500 mg/L IBA处理插穗的根原基诱导和愈伤组织形成，与较低水平的ABA含量有关。扦插后12～18 d，1 500 mg/L IBA处理插穗的ABA含量变化平稳，维持在较低水平，而对照处理插穗的ABA含量开始急剧下降，达到最低值95.25 ng/（g·FW），此时观察到对照处理插穗不定根开始发生，表明ABA的抑制作用在减弱。第18天以后，1 500 mg/L IBA处理插穗的ABA含量缓慢降低，36 d后回升，而对照处理插穗的ABA含量出现微升，30 d以后开始下降，42 d时与1 500 mg/L IBA处理的基本持平。

2.3.3 GA3含量的变化 1 500 mg/L IBA处理插穗的GA3含量扦插后缓慢上升，18～24 d保持在12.00 ng/（g FW）左右，第30天達13.22 ng/（g FW），而后急剧下降，第42天时降至6.89 ng/（g FW），接近扦插前插穗的GA3含量[7.5 ng/（g FW）]。对照处理扦插后GA3含量急剧下降，而后小幅上升，第24天后趋于平稳，维持在5.0 ng/（g FW）。整个扦插进程中，1 500 mg/L IBA处理的GA3含量始终高于对照（图2-C）。

2.3.4 ZR含量的变化 扦插后1 500 mg/L IBA处理插穗基部ZR含量急剧下降，从9.35 ng/（g FW）降至最低值8.04 ng/（g FW），而后快速上升，第12天时达到峰值10.01 ng/（g FW），第12天后下降平缓，保持在9.06 ng/（g FW）左右。对照处理扦插12 d内，ZR含量从9.35 ng/（g FW）持续上升到峰值11.88 ng/（g FW），而后急剧下降，第18天时降至最低值9.54 ng/（g FW），而后缓慢上升（图2-D）。除第18天特例外，在整个扦插进程中，1 500 mg/L IBA处理插穗基部ZR含量始终低于对照。

2.3.5 IAA/ABA比值的变化 如图3-A所示，IBA 1 500处理插穗IAA/ABA比值在扦插后12 d内大幅度升高，达0.89，此时正是插穗不定根原基形成和发育的时期，扦插12 d后急剧下降，第30天时出现一个较小的峰值，而后下降。对照处理插穗的IAA/ABA比值扦插后缓慢下降，第6天时达到最低值0.34，而后急剧上升，第18天时升高至最大值0.71。扦插18 d后，2个处理的IAA/ABA比值变幅不大，在30 d时出现第二个峰、谷值。

2.3.6 IAA/ZR比值的变化 如图3-B所示，扦插后18 d内，1 500 mg/L IBA处理的IAA/ZR比值呈先上升、后下降的单峰变化，第6天时达到峰值10.94，而对照处理的IAA/ZR比值则相反，先下降、后上升，第6天时达到谷值4.14。扦插18 d后2个处理的IAA/ZR比值均持续下降，降幅较接近。

3 讨论与结论

本研究清水处理下，53.6%的当年生半木质化插穗生根，表明裸花紫珠为较易生根的树种。有研究结果报道，对于一些易生根的针叶树种，植物生长调节剂IBA诱导生根效果不明显，如Hinesley等[16]用IBA（5～15 g/L）处理美国尖叶扁柏（Chamaecyparis thyoides）插穗以及Trueman等[17]用IBA（1.5～8 g/L）处理瓦勒买杉（Wollemia nobilis）插穗。然而，本研究结果则不同，4个IBA浓度处理均能显著提高裸花紫珠插穗的生根率，其中1 500 mg/L IBA处理的生根率最高为75.2%，比对照提高21.7个百分点。尽管如此，仍低于张浪等[8]报道的裸花紫珠的扦插生根率。原因在于，插穗的年龄不同，使用的激素种类和处理方法各不相同。对于木质化的插穗，采用根部浸泡的方法似乎更有效，而对于半木质化插穗，速蘸法优于浸泡法。

内源激素水平的高低与插穗生根能力密切相关[18]，而外源激素可以通过调节内源激素水平，间接影响不定根形成及根系的形成和发育[10-11，19]。在裸花紫珠扦插生根过程中，插穗基部IAA含量随生根阶段发生变化。IBA 1 500 mg/L处理的插穗在扦插第6天时至峰值，而后逐渐下降。形态观察发现，该阶段也是裸花紫珠插穗根部膨大、诱导启动阶段。Blakesley等[20]认为，山茱萸（Cornus）插穗早期内源IAA峰值与根原基启动有关。此外，裸花紫珠在插穗根原基诱导分化、愈伤组织形成阶段，1 500 mg/L IBA处理插穗的内源IAA始终高于对照，这可能是IBA影响了内源IAA的合成，或是外源IBA影响了与IAA合成相关的一些氧化酶活性的缘故。ABA一般被认为是扦插生根的抑制剂，在裸花紫珠扦插生根过程中，1 500 mg/L IBA处理的内源ABA含量普遍低于对照，可能是由于IBA处理影响了ABA的合成，致使内源ABA含量下降，从而提高了生根力，这与多数研究结果趋同[21-22]。裸花紫珠插穗经1 500 mg/L IBA处理后，也引起插穗内部细胞分裂素ZR下降。赤霉素的主要作用是促进植物茎的伸长，包括细胞分裂、细胞体积扩大等，其对插穗生根的影响比较复杂[23]。一些研究支持GA3抑制插穗不定根的形成[24]。但也有研究认为GA3可促进插穗不定根的形成。Nanda等[25]报道，GA3可以显著的促进和诱导树牵牛（Ipomoea fistulosa）木质化插穗的生根及叶芽萌发。潘瑞炽等[26]认为，GA3在较高浓度时抑制不定根的形成，但这种抑制作用是局部的。本试验扦插生根过程中，1 500 mg/L IBA处理插穗内源GA3含量在根原基诱导，不定根形成和发生阶段升高，且高于对照，表明1 500 mg/L IBA处理加速了内源GA3的合成，对裸花紫珠的扦插生根有利。低的ZR含量有利于落叶松[27]及绿豆（Vigna radiata）[28]插穗的生根。本研究结果发现，扦插0～6 d，ZR显著下降，6～12 d上升至最大，表明低水平的ZR有利于促进裸花紫珠根原基的诱导、分化，而后的升高则有利于根原基生长，这与李永欣等[29]对光皮树扦插过程中ZR的作用吻合。

植物扦插生根過程也是多种植物激素相互协同、制约的过程，不同激素含量比值的变化更能反应不定根形成能力。IAA/ABA和IAA/ZR比值常作为扦插生根难易的衡量标准[21]。一些学者认为，IAA/ABA、IAA/ZR的比值越大越有利于根原基诱导和分化，促进插穗生根[30-31]。本试验扦插0～12 d期间，1 500 mg/L IBA处理插穗基部IAA含量上升，同时ABA和ZR含量下降，致使IAA/ABA和IAA/ZR比值升高。

总之，外源激素IBA提高了裸花紫珠扦插生根率，降低了偏根率，生根效果显著的高于对照。在插穗不定根形成过程中，外源1 500 mg/L IBA处理调节了几种内源激素含量的变化，成为诱导插穗生根的直接或间接诱因。外源激素如何诱导内源激素的变化，以及内源激素对生根的影响及作用机理，比较复杂，还有待通过激素信号转导和分子生物学技术手段进一步探索研究。

参考文献

[1] 广东省植物研究所. 海南植物志第四卷[M]. 北京： 科学出版社， 1977.

[2] 王祝年， 韩 壮， 崔海滨， 等. 裸花紫珠的化学成分[J]. 热带亚热带植物学报， 2007， 15（4）： 359-362.

[3] 刘明生. 黎药学概论[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2008.

[4] 符 健， 邝少轶， 王世雄. 裸花紫珠片的抗菌消炎和止血作用研究[J]. 海南大学学报： 自然科学版， 2002， 20（2）： 154-157.

[5] 梁纪军， 徐 凯， 李留法， 等. 裸花紫珠总黄酮的抗炎， 止血作用研究[J]. 现代中西医结合杂志， 2009， 18（26）： 3 161-3 162.

[6] 马丽丽， 刘 萍. 裸花紫珠栓治疗宫颈炎疗效观察[J]. 中国医师杂志， 2004， 6（8）： 1144.

[7] 王红娟， 赵艳菊. 裸花紫珠阴道片辅料的研究及应用[J]. 西北药学杂志， 2007， 22（2）： 73-74.

[8] 张 浪， 姜殿强， 翁春雨， 等. 海南黎药裸花紫珠扦插育苗技术研究[J]. 中国农学通讯， 2013， 29（13）： 197-200.

[9] Epstin E， Ludwig-Muller J. Indole-3-butyric acid in plants： occurrence， biosynthesis， metabolism， and transport[J]. Physiol Plant， 1993， 88（2）： 382-389.

[10] Hinesley L E， Blazich F A. Influence of postservance treatments on the rooting capacity of Fraser fir stem cuttings[J]. Can J For Res， 1981， 11（2）： 316-323.

[11] Wiesman Z， Lavee S. Enhancement of IBA stimulatory effect on rooting of olive cultivar stem cuttings[J]. Scientia horticulturae， 1995， 62（3）： 189-198.

[12] Copes D L， Mandel N L. Effects of IBA and NAA treatments on rooting Douglas-fir stem cuttings[J]. New Forests， 2000， 20（3）： 249-257.

[13] Nordstrom A C， Jacobs F A， eliasson L. Effect of exogenous IAA and IBA on internal levels of the respective auxins and their conjugation with aspartic acid during adventitous root formation in pea cuting[J]. Plant Physiol， 1991， 96（3）： 856-861.

[14] 徐继忠， 陈四维. 桃硬枝插条内源激素（ABA， IAA）含量变化对生根的影响[J]. 园艺学报， 1989， 16（4）： 275-278.

[15] 吴望名， 陈永义， 黄金丽， 等. 应用模糊集方法[M]. 北京： 北京师范大学出版社， 1985.

[16] Hinesley L E， Blazich F K， Snelling L K. Progagation of atlantic white cedar by stem cutting[J]. Hort Science， 1994， 29（3）： 217-219.

[17] Trueman S J， Peters R F. Propagation of wollemi pine from tip cuttings and lower segmen cuttings does not require rooting hormones[J]. Scientia Horticulturae. 2006， 109（206）： 394-397.

[18] Haissig B E. Influence of indoly-3-aceitc acid on adcentious root primordia of brittle willow[J]. Planta， 1970， 95： 27-35

[19] Henrique A， Campinhos E N， Ono E O， et al. Effect of plant growth regulators in the rooting of Pinus cuttings[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology， 2006， 49（2）： 189-196.

[20] Blakesley D， Weston G D， Elliott M C. Endogeneous levels of indole-3-acetic acid and abscisic acid during the rooting of Cornus coggygria cuttings taken at different times of the year[J]. Plant Growth Regul， 1991， 10： 1-12.

[21] 鄭均宝， 刘玉军， 裴保华， 等. 几种木本植物插穗生根与内源IAA， ABA的关系[J]. 植物生理学报， 1991， 17（3）： 313-316.

[22] 詹亚光， 杨传平， 金贞福， 等. 白桦插穗生根的内源激素和营养物质[J]. 东北林业大学学报， 2001， 29（4）： 1-4.

[23] 赵晓敏， 霍常富， 沈海龙. 影响林木插条生根的内部及环境因子研究综述[J]. 世界林业研究， 2007， 20（5）： 12-16.

[24] Li H H， Pan R C. Hormone control of adventitious rooting in mung bean stem cuttings[C]. XV international botanical congress， Japan Pacifico Yokohama. 1993， 6183.

[25] Nanda K K， Anand V K， Chibbar R N. The promotive effect of gibberellica acid on the production of adventitious roots on stem cuttings of Ipomoea fistulosa[J]. Planta， 1972， 105： 360-363.

[26] 潘瑞炽， 李 玲. 植物生长发育的化学调控（第2版）[M]. 广州： 广东高等教育出版社， 1999.

[27] 刘桂丰， 杨传平， 曲冠正， 等. 落叶松杂种插穗生根过程中4种内源激素的动态变化[J]. 东北林业大学学报， 2001， 29（6）： 8-18.

[28] 王金祥， 潘瑞炽. 绿豆插条生根过程中内源激素含量变化[J]. 植物生理学通讯， 2004， 40（6）： 696-698.

[29] 李永欣， 曾慧杰， 王晓明， 等. 光皮树扦插过程中内源激素变化[J]. 中国农学通讯， 2010， 26（15）： 247-251.

[30] 郭素娟. 林木扦插生根的解剖学及生理学研究进展[J]. 北京林业大学学报， 1997， 19（4）： 64-69.

[31] 敖 红， 王 昆， 冯玉龙. 长白落叶松插穗的内源激素水平及其与扦插生根的关系[J]. 植物研究， 2002， 22（2）： 190-195.