双波长法测定木薯的直链和支链淀粉含量

郭运玲　孔华　左娇　贾瑞宗　黄启星　郭静远　周霞　郭安平

摘 要 直链淀粉和支链淀粉含量及其比例是木薯淀粉品质的重要指标。采用双波长法对30个木薯株系的直、支链淀粉的含量进行了测定，根据碘分别与直链和支链淀粉反应生成复合物的吸收光谱，我们最后确定了直链淀粉的和支链淀粉的参比波长和测定波长分别是609和469.5 nm、542和721 nm。根据回归方程得到了30个木薯株系的直链淀粉和支链淀粉的含量。本实验中用于测定木薯的直链淀粉浓度在0～26 μg/mL，支链淀粉浓度在0～100 μg/mL范围内符合比耳定律。结果表明： SC8不同株系的直链淀粉含量变化范围：14.879%～21.905%，支链淀粉含量变化范围：47.864%～56.955%；SC6不同株系的直链淀粉含量变化范围：15.494%～24.726%，支链淀粉含量变化范围44.292%～57.465%。该方法准确性高、重复性好、效率高，工作量小，适于批量木薯样品分析。

关键词 木薯；双波长法；直链淀粉；支链淀粉；

中图分类号 TS235.2 文献标识码 A

Abstract The content and proportion of amylose and amylopectin are important indices of cassava. A dual-wavelength method was applied to the determination of amylose and amylopectin in 30 cassava varieties. According to the absorption spectra of the two complexes， the determination of wavelength and reference wavelength of amylose， 609 nm and 469.5 nm， and the determination of wavelength and reference wavelength of amylopectin， 542 nm and 721 nm， were selected as the measuring wavelength. The content of amylose and amylopectin were figured out from the two regressive equations. Beer′s law was obeyed in 0-26 μg/mL for amylose and 0-100 μg/mL for amylopectin. The results showed that the amylose content of SC8 different strains was 14.879% to 21.905%， the amylopectin content was 47.864% to 59.955%； The amylose content of SC6 different strains was 15.494% to 24.726%， and the amylopectin content was 44.292% to 57.465%. The method had a good repetition and could be applied for analyzing plentiful samples of cassava due to its accuracy and rapidness.

Key words Cassava；Dual-Wavelength method；Amylose；Amylopectin

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.027

木薯（Manihot esculenta Crantz）属于大戟科块根作物，是热带、亚热带地区重要传统的经济作物和粮食作物，木薯是主要以地下块根形式储存合成的淀粉，木薯适应范围非常广，具有抗逆、耐贫瘠，以及生物量很高和淀粉含量高等多种特点。木薯淀粉在淀粉食品、工业原料等领域有十分广泛的用途，在中国木薯作为新兴的能源作物受到重视，木薯生产和加工产业有很大的发展前景[1]。木薯淀粉的主要成份是直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉和支链淀粉的组成比例直接影响着淀粉的化学特性以及加工用途[2]。测定淀粉含量及淀粉中直链淀粉、支链淀粉组成比例的方法有很多，如碘亲和力测定法、排阻色谱分析法、旋光法、国标法、双波长法和多波长法、比色法、近红外法、差示扫描量热法等。这些测定方法各有自己的特点和不足，如有的操作过程复杂，成本较高，或者不能很好把直链和支链淀粉区分开来，因此应用有一定的局限性[3-6]。淀粉的双波长测定方法主要是根据碘分别与直链淀粉和支链淀粉发生反应所生成的复合物颜色对吸收光谱的反应，直链淀粉与碘试剂发生反应生成深蓝色的复合物，而支链淀粉与碘试剂发生反应生成棕红色复合物，它们的吸收光谱不同。本课题组通过直链淀粉/支链淀粉的标准样品经过碘试剂处理后所发生的反应，通过液相色谱扫描获得各自的吸收光谱，然后运用作图方法找到适合测定直链淀粉与支链淀粉的2种波长，并建立它们的标准曲线。由于本方法具有准确性高、重复性好、效率高，工作量小，成本低等特点，已成为植物淀粉测定的常用方法[7-14]。在木薯直链/支链淀粉测定中，黄惠芳等[15]利用该方法对木薯GR891品种的直链和直链淀粉测定过程中样品处理温度进行了研究。因此本研究采用該方法对30份木薯样品进行直链和支链淀粉的的测定，获得了30份木薯样品的直链/支链淀粉的含量，从而得到每个木薯样品的总淀粉含量。

RNA干扰技术和反义技术是人为控制基因表达的直接有效方法，已经成为人们在基因工程技术中使用的有效手段和工具[16]，在水稻、玉米和马铃薯等农作物上利用该手段改变淀粉组成等都有成功的报道[17-19]。本研究中所测定的30份木薯材料中，除了2个对照亲本外，28份是利用RNA干扰技术和反义技术获得的转基因植株，因此本试验采用双波长比色法对所获得的28个转基因植株及2个对照亲本（SC6和SC8）淀粉含量和直链/支链淀粉含量进行测定，比较淀粉组分是否发生变化，从而比较RNA干扰技术和反义技术在改良木薯淀粉品质上的效果，同时为木薯产品加工及木薯淀粉品质的遗传改良及生理指标分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试木薯块根 木薯块根采自种植于海南省文昌市农业部转基因植物及植物用微生物環境安全监督检验测试中心（海口）试验基地的28个木薯转基因株系及2个对照亲本材料（SC6和SC8）。为了保证试验结果的可靠性，供试材料统一时间种植在相同地块，栽培管理措施相同。在木薯成熟期鲜薯采后洗干净切片（丝），105 ℃烘箱烘干至恒重，将木薯干（丝）粉碎后经过100目筛，然后用石油醚进行脱脂，再在80 ℃烘箱中烘干至恒重，脱脂后的木薯干粉用于淀粉含量和淀粉组分的测定分析。

1.1.2 实验所用仪器 美国PerkinElmer公司生产的Lambda35紫外-可见分光光度计、恒温鼓风干燥箱（国产）、粉碎机（美的牌）、索氏抽提器、江苏金坛市医疗器械厂生产的HH-S4数显恒温水浴锅、电子分析天平。

1.1.3 实验所需试剂 直链淀粉与支链淀粉标准样品由美国sigma公司生产，氢氧化钾、盐酸、无水乙醇、石油醚、碘和碘化钾均为国产分析纯。

碘试剂：先称取碘化钾2.0 g，用少量蒸馏水溶解后再加入碘0.2 g，待碘完全溶解后用蒸馏水稀释定容至100 mL贮藏于棕色磨口试剂瓶中。碘试剂一般现配现用。

1.2 方法

30份木薯块根干粉中总淀粉含量和直链淀粉/支链淀粉组成比例的测定方法主要参考戴双等[8]的方法。

1.2.1 直链淀粉和支链淀粉标准溶液的配制 称取购于sigma公司的直链淀粉标准样品0.100 0 g，将它加入100 mL容量瓶中，参考戴双等[8]的方法配制1 mg/L直链淀粉标准溶液。然后配制浓度分别为0、2、6、10、14、18、22、26 μg/mL的系列直链淀粉标准溶液。按照上述同样的方法配制浓度分别为0、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的支链淀粉标准溶液。

1.2.2 直链淀粉和支链淀粉测定波长的选择 先分别选取直链淀粉的26 μg/mL标准溶液和支链淀粉的100 μg/mL标准溶液，再将它们分别在分光光度计上进行400～1 000 nm的波段光谱扫描，获得直链/支链淀粉的吸收光谱图，然后采用作图方法获得了木薯直链淀粉测定波长为λ1值为609 nm，它的参比波长λ2值为469.5 nm；木薯支链淀粉的测定波长λ3值为542 nm，它的参比波长λ4值为721 nm。

1.2.3 双波长木薯淀粉测定的标准曲线绘制 （1）双波长木薯直链淀粉测定标准曲线绘制：参考戴双等[8]的方法，将配制好的用于测定木薯直链淀粉的系列标准溶液在λ1值为609 nm和λ2值为469.5 nm的双波长下分别测定得到它们的吸光度为Eλ1、Eλ2，吸光度差值△E=Eλ1-Eλ2。然后以吸光度差值△E值为横坐标，以直链淀粉标准溶液浓度为纵坐标，绘制即得到双波长木薯直链淀粉测定的标准曲线。

（2）双波长木薯支链淀粉测定标准曲线绘制。同样参考戴双等[8]的方法，将配制好的用于测定木薯支链淀粉的系列标准溶液在λ3值为542 nm和λ4值为721 nm 2个波长下分别测定得到它们吸光度Eλ3、Eλ4，吸光度差值△E=Eλ3-Eλ4。然后以吸光度差值△E为横坐标，以支链淀粉标准溶液浓度为纵坐标，绘制即可得到双波长木薯支链淀粉测定的标准曲线。

木薯样品总淀粉含量即为木薯直链淀粉的含量与木薯支链淀粉含量之和。

1.2.4 双波长比色法测定木薯块根中淀粉的含量 分别称取30份经过脱脂处理的木薯淀粉样品各0.100 g左右，先加入适量的无水乙醇湿润透，然后加入10 mL浓度为 1 mol/L氢氧化钾溶液，再放入75 ℃热水浴中振荡15 min，待完全溶解后取出，稍冷却后加入蒸馏水定容至50 mL，静置20 min。分别吸取3 mL木薯样品溶液作为木薯样品的测定液和样品空白液，然后各加入20～30 mL蒸馏水，以0.1 mol/L浓度盐酸调节pH值为3.5左右，在木薯样品测定液中加入0.5 mL碘试剂，将木薯样品的测定液和样品空白液定容至50 mL，摇匀后静置20 min，再以样品空白液作为对照，分别对30份木薯样品的测定液用分光光度计在λ1值为609 nm、λ2值为469.5 nm、和λ3值为542 nm、λ4值为721 nm这4个波长下测定得吸光度，再根据木薯样品的直链淀粉和支链淀粉的双波长测定标准曲线计算出木薯样品的直链淀粉和支链淀粉的含量，直链淀粉和支链淀粉二者相加即可得到木薯样品总淀粉的含量。每个样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 木薯直链淀粉测定标准曲线的建立

以木薯直链淀粉的测定波长为λ1值609 nm，参比波长为λ2值469.5 nm的吸光度差值△E值为横坐标，以直链淀粉标准溶液浓度为纵坐标，绘制得到了木薯直链淀粉测定的标准曲线（图1），拟合方程式为：y=244.3x-1.636，R2=0.996，说明用于木薯直链淀粉测定的标准曲线制作良好，直链淀粉质量浓度在26 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，符合比耳定律。

2.2 木薯支链淀粉测定标准曲线的建立

以木薯支链淀粉的测定波长λ3值为542 nm，参比波长λ4值为721 nm的吸光度差值△E值为横坐标，以支链淀粉标准溶液浓度为纵坐标，绘制得到了木薯支链淀粉测定的标准曲线（图2），拟合方程式为：y=506.4x+3.968，R2=0.999。也说明了用于木薯支链淀粉测定的标准曲线制作良好，支链淀粉质量浓度在100 μg/mL范围内呈现很好的线性关系，符合比耳定律。

2.3 华南木薯SC8及15个转基因木薯样品的直链、支链及总淀粉含量测定

从表1中可以看出，对照亲本SC8直链淀粉含量为17.354%，支链链淀粉含量55.563%，总淀粉含量72.917%，15个转基因株系中，直链淀粉含量变化范围：14.879%～21.905%，支链淀粉含量变化范围：47.864%～56.955%，支链/直链比变化范围：2.460～3.906。其中8（2S）15直链淀粉含量为21.905%，比对照SC8高26.22%。15个转基因株系中，有8个直链淀粉含量比对照有所提高，其中有2个的差异达到显著水平，说明转入的淀粉分支酶干扰载体对木薯支链淀粉合成起了一定的干扰作用，从而提高了直链淀粉的含量。

2.4 SC6及13个转基因木薯株系样品的直链、支链及总淀粉含量测定

从表2中可以看出，对照亲本SC6直链淀粉含量为16.779%，支链淀粉含量57.465%，总淀粉含量74.244%，13个转基因株系中，直链淀粉含量变化范围：15.494%～24.726%，支链淀粉含量变化范围44.292%～57.465%，支链/直链比变化范围：1.969～3.384。其中6J9（8）直链淀粉含量为24.726%，与SC6相比较提高了47.36%；6（2S）6直链淀粉含量23.401%，与对照亲本SC6相比较提高了39.47%。13个转基因株系中，有8个直链淀粉含量比对照高，其中有3个的差异达到显著水平。说明转入的淀粉分支酶干扰和反义载体基因对木薯支链淀粉合成起了一定抑制作用，从而提高了直链淀粉的含量。

3 讨论

3.1 木薯淀粉标准溶液的确定和测定波长选择

本实验中选择了木薯直链淀粉测定的最大的标准溶液为26 μg/mL， 木薯支链淀粉测定的最大的标准溶液为100 μg/mL。跟已有文献报道相同[7，9-13]。对标准溶液在分光光度计上进行400～1 000 nm光谱段扫描，分别获得木薯直链淀粉和支链淀粉的吸收光谱图，再用作图方法获得木薯直链淀粉的测定波长和参比波长分别为609和469.5 nm，木薯支链淀粉的测定波长和参比波长分别为542和721 nm。直链淀粉和支链淀粉分别在609和542 nm处有最大吸收峰。本实验采用的直链淀粉与支链淀粉标准品为美国sigma公司生产，标准品不同，尤其是纯度不同，获得的测定波长会有差异。加列西·马那甫等[13]对淀粉的直链淀粉和支链淀粉测定分析，他们采用的作图方法确定了谷物类和豆类淀粉的直链淀粉的测定波长和参比波长分别为565和495 nm，支链淀粉的测定波长和参比波长分别为530和654 nm。金玉红等[9]在测定小麦的直链和支链淀粉中采用的择直链淀粉的测定波长为631和480 nm，支链淀粉的测定波长为554和754 nm。前人对高梁及多种粮豆作物做了测定，样品不同测试结果会有很大的差异[7，10-12]。大米直链淀粉测定有国标GB/T15683-2008[20]，该方法采用单波长720 nm处的吸光度，对大米等谷物类淀粉的测定比较有效，而对于木薯等块根类淀粉，采用双波长测定方法更有效。

3.2 木薯直链淀粉和支链淀粉测定标准曲线的建立

本实验中直链淀粉的浓度在0～26 μg/mL，支链淀粉浓度在0～100 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，符合比耳定律。已有文献报道，在小麦、高粱等禾谷类作物以及烟草、豆类、银杏等方面研究表明，直链淀粉浓度一般在0～80 mg/L，支链淀粉的浓度在0～400 mg/L范围内符合比耳定律[7，9-13]。利用该方法测定直链和支链淀粉，不同作物标准曲线会有差异，但是只要符合比耳定律，都是有效的。

3.3 木薯样品淀粉组分的测定

实验数据表明，该方法对木薯淀粉样品的测定重复性好，因此是准确有效的。淀粉中一般直链淀粉含量在25%左右，支链淀粉含量在75%左右。古碧等[2]采用单波长法，在620 nm处对79份木薯品种（系）的直链和支链进行了测定，结果表明，直链淀粉含量在15.52%～25.02%，支链淀粉74.98%～84.48%。其中SC6直链淀粉含量20.06%，直链淀粉79.94%，SC8直链淀粉含量18.27%，直链淀粉81.73%。本实验中SC6不同转基因株系直链淀粉含量15.494%～24.726%，支链淀粉含量变化范围44.292%～57.465%，SC8不同转基因株系的直链淀粉含量变化范围：14.879%～21.905%，支链淀粉含量变化范围：47.864%～56.955%。折算成百分百的含量则是：SC6不同转基因株系直链淀粉含量22.600%～33.681%，支链淀粉含量为67.854%～77.400%， SC6直链淀粉含量为22.600%； SC8不同转基因株系直鏈淀粉含量为23.800%～30.906%，支链淀粉含量为69.094%～76.200%，SC8直链淀粉含量为23.800%。测定方法不同，样品取样时间和栽培地点不同，管理方法不同，测定结果会有差异。因此，在取样时最好根据实验目的来确定木薯样品的收获时间。尤其是在试验开始设计时就要综合考虑这些影响因素。本研究是在查阅大量文献的基础上确定双波长法测定木薯淀粉组分，从结果和重复性及操作上来看，该方法是有效的。是否有更有效的测定方法有待下一步做全面系统的测定方法比较实验。

4 结论

采用双波长比色方法对30份木薯不同株系的直链淀粉和支链淀粉的含量进行了测定，根据碘分别与直链淀粉和支链淀粉反应生成的复合物吸收光谱的不同，确定了30份木薯的直链淀粉和支链淀粉参比波长和测定波长分别为609和469.5 nm，542和721 nm。根据回归方程得到了30份木薯不同株系的直链淀粉和支链淀粉含量。本实验中木薯的直链淀粉的浓度在0～26 μg/mL，支链淀粉浓度在0～100 μg/mL范围内符合比耳定律，由回归方程计算得到了木薯直链和支链淀粉含量。16份木薯SC8不同株系的直链淀粉含量变化范围：14.879%～21.905%，支链淀粉含量变化范围：47.864%～56.955%；14份木薯SC6不同株系的直链淀粉含量变化范围：15.494%～24.726%，支链淀粉含量变化范围：44.292%～57.465%。

致谢 感谢赖丁王、徐林在标准样品的制备和淀粉组分测定中做的大量工作。

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