不同木薯品种体细胞胚及芽器官发生能力的研究

曾文丹　陆柳英　谢向誉　严华兵

摘 要 通过对不同优良木薯品种体细胞胚胎及芽器官发生能力进行比较研究。结果表明，不同品种之间的体细胞胚胎和芽器官发生能力因基因型不同而差异显著。KU 50体细胞胚发生率最高，为81.33%，其次为SC 205，诱导率为61.33%。而RYG 60未成功诱导出初生体细胞胚。诱导的体细胞胚经循环继代培养可形成次生胚状体。将次生胚状体转入成熟培养基，经光培养后可形成绿色的成熟体细胞胚，进而再生成植株。以KU 50体细胞胚萌发率最高，为42.2%。以子叶为外植体比以膨大的腋芽为外植体诱导初生体细胞胚的发生率高，除SC 205和NZ 199外，其余品种的诱导率均在85%以上。其中以新选048诱导效果最好，可达91.67%。将子叶切片置于器官发生培养基上可诱导不定芽的发生，诱导频率变幅为12.3%～71.0%，其中MCol 22和新选048诱导效果较好。

关键词 木薯；基因型；体细胞胚胎发生；芽器官发生；再生植株

中图分类号 S533 文献标识码 A

Abstract A comparative study of the capacity of somatic embryogenesis and shoot organogenesis using different cassava cultivars was done. The results showed that there was a significant difference in the capacity of somatic embryogenesis and shoot organogenesis between different cassava cultivars due to different genotypes. Incidence of the somatic embryo of KU 50 was the highest，thatwas 81.33%； and the next was the SC 205， that was 61.33%. And the somatic embryo of RYG 60 was not induced. Secondary SE was establised in mature medium to induce green mature somatic embryogenesis and then the plants were grown after culture using light. Somatic embryo germination rate of KU 50 was the highest，that was 42.2%. Inducing rate of primary somatic embryos using the cotyledon was higher than using swollen axillary buds. Inducing ratewas over than 85% in all varieties except SC 205 and NZ 199. The inducing effect of Xinxuan 048 was the best， that was 91.67%. The formation of adventitious buds could be induced though cotyledons slice were incubated in organ culture medium and the inducing rate was between 12.3% and 71.0%； The inducing effect of MCol 22 and Xinxuan 048 was the best.

Key words Cassava； Genotype； Somatic embryogenesis； Shoot organogenesis； Plant regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）用途广泛，不仅是非洲地区重要的粮食作物和世界重要的工业原料，且在生物能源开发和利用中占有非常重要的地位，经济价值和开发应用潜力大[1-3]。木薯遗传背景复杂，有性子代分离严重，为典型的无性繁殖作物，加上生产周期较长，开花难、花粉育性低、自交不亲和、坐果率低等因素，应用常规育种技术难以实现品种的目标性状的定向遗传改良[4-5]。基因工程技术是将一些重要的农艺性状基因（如抗病、抗虫，产量和品质等）导入目的作物，实现农作物定向改良的一种快速育种手段。倪万潮等[6]将人工合成的Cry1A基因导入棉花，获得了高抗棉铃虫的转基因植株。Lucca等[7]采用转基因技术提高了水稻植株对铁元素的生物利用率和吸收率，使大米中铁元素含量明显增加。与其他作物相比，木薯的生物技术起步晚，自1982年Stamp等[8]首次报道木薯体细胞胚发生以来，大多的研究主要针对非洲和南美洲的一些传统品种（如TMS60444）的体细胞胚研究。我国木薯体细胞胚发生和再生植株的报道主要是集中在外植体选择、激素和碳源种类及浓度的筛选、培养方式等影响因子[9-13]。对多数木薯品种诱导体细胞胚的发生能力而言，以Picloram比2，4-D诱导效率高[14]。Groll等[15]研究发现次级体细胞胚在含活性炭和0.1 μmol/L ABA的培养基上能更快速的分化和萌发；在体细胞胚成熟培养基中添加活性炭更有助于体细胞胚的成熟。Mathews等[16]認为体细胞胚成熟后经脱水处理，可显著提高体细胞胚的再生率。张鹏等[17]研究发现在芽器官发生培养基中添加AgNO3可明显增加木薯不定芽的发生能力，增加再生芽的数量。

构建离体再生体系是开展生物技术的基础。木薯离体再生和遗传转化与基因型密切相关，探讨不同基因型品种间的高效再生体系已成为当前木薯基因工程研究的重要课题。本研究拟采用木薯体细胞胚诱导及其植株再生培养技术[18-19]，分析比较优良木薯品种间体细胞胚发生率及芽器官发生率，筛选出适宜于木薯植株再生体系构建的优良品种，为木薯品种基因工程改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以木薯品种新选048、SC 205、NZ 199、MCol 22、KU 50、R-90、RYG 60为试验材料。材料以试管苗的形式在基本培养基CBM上继代保存。CBM培养基成分：MS盐及其维生素、0.5 mg/L CuSO4、2%蔗糖和0.6%瓊脂粉。pH值为5.8。继代培养条件：温度（27±1） ℃、光照时间16 h/d、光照强度1 500～2 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 不同品种间体细胞胚发生及植株再生能力

（1）体细胞胚的诱导。选取继代培养3～4周的组培苗，切去其顶芽后将带侧芽的茎段水平放置诱导芽膨大培养基CAM（CBM+10 mg/L 6-BA）上，采用16 h/d光照培养3～5 d，在体式显微镜下用5号针头挑取膨大的腋芽，放置体细胞胚诱导培养基CIM（CBM+12 mg/L Picloram）上诱导体细胞胚。每个处理接种4个平皿，每个平皿接种芽分生组织25个，重复3次。接种后暗培养，培养温度（27±1） ℃，每4～5 d观察1次，14 d后统计体细胞胚的诱导率及其产胚量。

（2）体细胞胚的继代培养与次生胚状体的形成。将诱导的初生体细胞胚从培养组织块剥离，置于新鲜相同培养基上继代培养，诱导和扩增次生胚状体。2～3周后继代1次，观察并统计体细胞胚增殖速率。

（3）体细胞胚的成熟与萌发。将次生体细胞胚移置成熟培养基CMM（CBM+0.1 mg/L 6-BA），采用光照培养直至子叶明显长大并变绿。每个处理接种4个平皿，每个平皿接种25个外植体，重复3次。14 d后统计体细胞胚成熟率。将成熟胚转移置CBM培养基上诱导萌发，30 d后统计成苗率。培养条件：温度（27±1） ℃、光照时间16 h/d、光照强度1 500～2 000 lx。

（4）体细胞胚子叶诱导次生体细胞胚的发生。取诱导14 d后的成熟子叶为外植体，用解剖刀切成大小为0.04～0.25 cm2子叶切片，移置体细胞胚诱导培养基CIM上，采用暗培养诱导次生胚状体。每个处理接种4个平皿，每个平皿接种外植体25个，重复3次。

1.2.2 不同品种间芽器官发生能力

（1）成熟体细胞子叶切片诱导芽器官的发生。取诱导14 d后的成熟子叶为外植体，用解剖刀切成大小为0.04～0.25 cm2子叶切片，移置芽器官发生培养基COM（CBM+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+4 mg/L AgNO3）上。每个处理接种4个平皿，每个平皿接种25个外植体，重复3次。培养条件同诱导体细胞胚成熟。3周后观察不定芽诱导情况。将带有芽原基及其再生不定芽的膨大培养小块转入芽伸长培养基CEM（CBM+0.4 mg/L 6-BA），经培养后获得再生苗。

（2）不定芽生根培养。将上述再生苗转入生根培养基（1/2 MS+0.02 mg/L NAA+20 g/L蔗糖）中进行生根培养。培养条件同诱导体细胞胚成熟。

1.2.3 再生植株的移栽 待组培幼苗生长健壮、根系较发达，株高长至5 cm左右时，移入温室炼苗，放置7 d左右，拧松瓶盖，使瓶内环境与外界相当，让组培苗在自然状态下驯化3～5 d后，洗净幼苗附着的培养基，移植于栽培基质（泥沙 ∶ 草炭土=1 ∶ 2）中。30 d后统计成活率。

1.3 统计与分析

所得数据采用SPSS 18.0和Excel 2010软件进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同木薯品种初生体细胞胚的发生及其继代增殖

挑取膨大的芽分生组织（图1-A），放置到体细胞胚诱导培养基诱导初生体细胞胚（图1-B）的形成。由表1可知，7个木薯品种均能成功诱导愈伤组织的发生，除RYG 60外，其余木薯品种愈伤组织诱导率差异不显著。且试验中发现产生的愈伤组织类型不同，一类为非胚性愈伤组织，其愈伤组织透明，海绵状，结构疏松；另一类为胚性愈伤组织，其质地较脆。所测试品种中KU 50体细胞胚发生率最高，为81.33%，其次为木薯品种SC 205，其诱导率为61.33%。RYG 60未成功诱导体细胞胚。木薯品种新选048、MCol 22、KU 50产胚量显著高于其他品种，分别为4.2、5.0、4.6个。SC 205产胚量低，仅为1.97个。结果表明木薯品种的基因型是决定体细胞胚胎发生的关键因素之一。

因随着体细胞胚的继代增殖，非胚性愈伤生长速度较初生体细胞胚快，需于1周内将诱导的初生体细胞胚剥离进行继代培养，诱导次生体细胞胚（图1-C）的发生。在相同的继代培养基上，胚状体的增殖速率和形态也明显受基因型的影响。木薯品种新选048、MCol 22、KU 50、R-90次生胚的发生率较高，在2周内即可扩增2倍以上，而SC 205和NZ 199次生体细胞胚发生率低。不同木薯品种所诱导的胚状体形态也各不相同（图2）。

2.2 体细胞胚的成熟和萌发

将次生体细胞胚转置于成熟培养基培养。14 d左右，体细胞胚明显膨大并形成绿色成熟子叶胚（图1-D）。由表2可见，除SC 205、NZ 199外，其余品种胚状体成熟率均在80%以上。将成熟体细胞胚转入CBM培养基诱导植株再生。其中，KU 50成苗率最高，为42.2%，SC 205成苗率最低，为6.2%。其他品种的成苗率为25%～35%。

2.3 成熟胚状体子叶切片诱导次生体细胞胚发生

取诱导14 d的成熟子叶作为外植体，用解剖刀将其切成0.04～0.25 cm2的子叶切片（图1-E），移置CIM培养基诱导次生胚状体。培养5 d左右，子叶切口边缘形成愈伤组织，继续暗培养，愈伤组织边缘形成球状胚，最终胚状体逐渐增多并长大（图1-F）。由表3可知，以子叶为外植体，体细胞胚的发生率比以膨大的腋芽为外植体高。所测品种中，新选048体细胞胚发生率最高，为91.67%，产胚量为8.47个。MCol 22、KU 50、R-90体细胞胚发生率均在80%以上。NZ 199体细胞胚发生率最低，仅为30.33%，产胚量为1.67个。

2.4 成熟胚状体子叶切片诱导芽器官发生

取诱导14 d的成熟子叶切片移置芽器官发生培养基诱导不定芽。光照培养3～5 d后，切片边缘先形成愈伤组织，部分子叶边缘向上卷曲，继续培养10 d左右，子叶切片的切口处形成芽原基，进而发育成从生小芽（图1-G）。由图3可知，不同基因型品种其芽器官的发生能力存在显著差异。其中以MCol 22和新选048子叶不定芽的发生率较高，分别为71%和62%。而NZ 199子叶不定芽的发生率仅为12.3%。

2.5 再生植株的移栽与成活

将体细胞胚萌发及芽器官发生所形成的小苗（图1-H）转入生根培养基中培养，4～6周后形成再生植株（图1-I）。

由图4可知，基因型对木薯的移栽成活率也有一定程度的影响。所测试的6个品种中，新选048、MCol 22、NZ 199移栽成活率均达到80%以上，其中以MCol 22移栽成活率最高，为89.5%。R-90的移栽成活率最低，为66.4%。

3 讨论

建立一套高效的植株再生及基因转化体系是利用基因工程开展作物遗传改良的基础和关键。木薯的离体植株再生途径分为两种，即器官和体细胞胚胎发生途径。其中器官发生途径又分为间接器官发生途径和直接器官发生途径[20]。本研究借鉴并优化了张鹏等[18]和Bull等[19]的木薯体细胞胚诱导及植株再生方法，研究不同优良木薯品种的体细胞胚直接再生途径和子叶诱导不定芽器官发生途径。目前，木薯体细胞胚的诱导大部分以膨大的腋芽为外植体进行体细胞胚诱导[21]。本研究发现部分木薯品种（如新选048）以膨大的腋芽为外植体，体细胞胚的发生率仅为40.33%，而以子葉切片为外植体，诱导率高达91.67%；此外，在显微镜下挑取膨大的腋芽进行体细胞胚诱导，需要丰富的经验和娴熟的技术，人为因素误差大，不宜大规模培养。而以子叶切片为外植体诱导体细胞胚的发生操作简单，且诱导率高，是理想的外植体材料。

本实验7个供试品种中，KU 50的植株再生率最高，但仅为42.2%。由此可见，木薯体细胞胚直接再生植株仍存在一定的困难。这与朱文丽等[13]的研究结果一致。因此，如何通过优化培养基或培养条件，提高木薯体细胞胚直接再生率，有待下一步的研究和完善。

初生体细胞胚的诱导和芽器官发生受基因型影响很大，虽然初生体细胞胚可以通过不同诱导条件获得，但不同品种间的诱导率存在显著差异[22]。Dohm等[23]选用50个月季品种进行体细胞胚诱导，结果表明仅有69%的品种成功诱导初生体细胞胚，并且不同品种间诱导率差异显著。Pelissier等[24]和黄先群等[25]探讨了不同基因型向日葵体细胞胚的发生能力，结果表明不同基因型之间的体细胞胚发生率和平均胚数差异达到极显著水平。方佳敏等[5]和赵珊珊等[14]研究发现不同木薯品种之间的体细胞胚胎发生和芽器官发生能力因基因型不同而差异显著。本实验对7个不同木薯品种的体细胞胚和不定芽发生能力的研究表明，基因型起着关键作用。在体细胞胚的诱导、继代、成熟、再生以及芽器官发生等培养过程中，品种间的差异明显，特别是初生体细胞胚的诱导率其差异达到极显著水平。以诱导彭大的腋芽为外植体时，KU 50其诱导率达到81.33%，而RYG 60的诱导率为0。以子叶为外植体时，新选048的诱导率达91.67%，而NZ 199的诱导率仅为30.33%。在不定芽发生率中，以MCol 22和新选048的诱导率分别为71.0%和62.0%。SC 205和NZ 199的发生率较低，仅为17.3%和12.3%。木薯模式品种TMS60444已建立了成熟的脆性胚性愈伤体系结合农杆菌转化方法，成功获得抗木薯非洲花叶病毒、蛋白质改良等转基因品系。而在其他品种鲜有成功的试验报道。因此，通过开展不同优良木薯品种的此类研究，扩宽优良基因型的选择，对木薯基因育种工程具有重要意义。本试验所试木薯品种新选048具有长势旺、适应性强、丰产性好等特点，在生产上具有广泛的应用前景。其体细胞胚诱导和芽器官再生能力都较强，是开展国内木薯转基因育种、诱变育种的理想材料。木薯品种KU 50和SC 205体细胞胚发生能力较强，可通过对培养基等条件的优化提高其器官发生能力，也可作为下一步遗传转化品种的优选品种。

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