橡胶树HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2的表达分析

李博勋　陈奕鹏　田维敏　陈珊　黄贵修

摘 要 植物营养储藏蛋白VSP2是HAD家族蛋白（haloalcanoic acid dehalogenase super family， HAD）的主要成员之一。该蛋白具有酸性磷酸化酶的功能，在橡胶树氮素储存和植物凝集素防御胁迫中发挥着重要的作用。在前期研究中，利用cDNA-AFLP获得了1条与橡胶树棒孢霉落叶病抗病性相关的差异表达片段EST-IAN-24，通过Blast比对分析，发现该基因片段与其他物种的VSP2基因具有较高同源性。采用PCR和RT-PCR技术，克隆获得了一个橡胶树VSP2基因的cDNA和基因组序列，并将该基因命名为HbVSP2。基因序列分析显示，该基因编码区全长（CDS）975 bp，含有4个内含子和5个外显子，编码324个氨基酸，推测该蛋白的分子质量为30.01 ku，等电点为4.80。该基因蛋白是HAD家族蛋白中的酸性磷酸酶，具有DXDXT基序特征。qRT-PCR 定量分析发现，受多主棒孢病菌侵染后，HbVSP2基因在橡胶树抗、感品种中的表达量存在着明显的差异，抗病品种（IAN873）的表达量显著高于感病品种（PR107），且在接种12 h達到了峰值；此外，该基因在水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯的处理下均能诱导其表达，对茉莉酸甲酯的敏感性明显高于其他2个激素。本研究初步表明，HbVSP2基因可能参与橡胶树与多主棒孢病菌的互作并且与抗病性相关。

关键词 橡胶树；HbVSP2基因；克隆；表达分析

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract VSP， Vegetative storage protein， is one of the main members of haloalcanoic acid dehalogenase super family（HAD）. It has acid phosphatase activity and plays an important role in nitrogen storage and plant lectin defense in rubber tree. In earlier study， we got a differential expression fragment related to Corynespora cassicola resistance in rubber tree with cDNA-amplified fragment length polymorphism（cDNA-AFLP）technology. Blast results showed that this fragment had high homology with VSP2 in other gene species. Using RT-PCR and PCR technology， cDNA and genomic sequences of a rubber tree VSP2 encoding gene OR VSP2 were cloned， and the gene was named as HbVSP2. Sequence analysis revealed that the CDS length of HbVSP2 was 975 bp， encoding a protein of 324 amino acids with molecular weight of 30.01 kD， and pI value of 4.80. Exon/intron structure analysis revealed 5 exons and 4 introns in HbVSP2 genomic sequence. The gene was an acid phosphatase gene，which had the characteristic of DXDXT domain in HAD family protein. The expression pattern of HbVSP2 in rubber plants was assessed by qRT-PCR. The tissue-specific expression analysis indicated that the HbVSP2 was mainly expressed in the stem. When C. cassiicola infected， the expression level of HbVSP2 was significantly higher in the resistant rubber germplasm（IAN873）than in the susceptible rubber germplasm（PR107）. The expression of HbVSP2 was up-regulated under ethylene， salicylic acid and methyl lasmonate treatment， especially methyl jasmonate. These results showed that HbVSP2 involved in rubber tree resistance signal pathway.

Key words Hevea brasiliensis； HbVSP2； Cloning； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.010

植物营养储藏蛋白（Vegetative Storage Proteins， VSPs）是植物营养组织中，氮素和氨基酸临时储存的主要形式，对减少植物在越冬期间营养物质的损失、生物量的积累以及抵抗不良环境的能力具有重要作用[1]。相关研究都充分肯定了植物营养贮藏蛋白质（VSPs）在氮素贮藏，植物凝集素积累，以及具有酸性磷酸化酶活性等方面的重要功能[2-4]，而VSP2作为植物防御相关蛋白的研究较少。VSP2是一种植物防御蛋白，能被多种因素如病虫侵害、创伤、茉莉酸甲酯等诱导表达，在参与植物抗病信号传导途径中的茉莉酸信号途径中发挥着重要的作用[5-6]。VSP在分类上属于HAD家族成员，具有保守的的DXDXT基序[7]。Liu等[8]发现VSP2能明显延迟昆虫的发育和增加其死亡率，将保守基序DXDXT中亲和的Asp119进行点突变成谷氨酸，会导致VSP2酸性磷酸化酶活性完全丧失，同时抗虫活性也完全丧失。Berger等发现vsp1和vsp2 mRNA及蛋白的表达能被昆虫的食草作用诱导[5]。cev1突变体组成型表达VSP1和VSP2，具有更高的抗病性[6]。上述研究揭示了拟南芥中的VSP2可能是一种防御蛋白，其防御功能与酸性磷酸酶的活性有关。

本研究前期利用cDNA-AFLP技术筛选到一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的基因片段EST-IAN-24，该基因片段与植物抗病相关的HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2具有高度的同源性，目前有关VSP2基因在橡胶树中的作用机理和表达特性等研究国内外尚未见报道。因此，本文对橡胶树VSP2基因进行克隆，通过qRT-PCR分析该基因的组织表达特性，分析病原菌诱导后在橡胶树抗病和感病种质中的表达差异，以及不同外源激素处理后的表达特性，为揭示VSP2基因在橡胶树中的作用机理以及橡胶树分子抗病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株为本实验室分离保存的多主棒孢病原菌菌株YN49。供试橡胶树品种为IAN873和PR107，取自中国热带农业科学院环境与植物保护研究所橡胶、木薯抗病性育种材料保存基地。琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Biomiga公司；反转录第一链合成试剂盒Prime ScriptTM RTreafent Kit with gDNA Eraser（RR047A），SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa， Code：DRR036A），实时荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡTli RNaseH Plus（RR820A）均购自TaKaRa公司；RNA plant plus Reagent植物总RNA提取试剂（DP441）购自天根生化科技有限公司。荧光定量PCR分析仪ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 DNA和总RNA提取 采用CTAB法对IAN873橡胶叶片的DNA进行提取。参照RNA提取试剂盒说明书，对橡胶叶片，以及不同组织器官根、茎、叶的RNA进行提取。通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，在紫外分光光度计下测定其在230 、260、280 nm处的吸光值，确保RNA样品的纯度。反转录cDNA用18S rRNA基因扩增检测cDNA第一链的合成质量。

1.2.2 基因克隆 将差异片段序列在NCBI网站上利用Blastn程序进行同源性比对分析，同时也与中国热带农业科学院橡胶研究所提供的橡胶树品种‘热研7-33-97基因组序列进行比对，获得包含该基因片段的大片段序列，将该序列在Softberry（http：//www.softberry.com）上进行目的基因的预测，选用已知的模式植物全基因组序列，对基因全长进行预测，获得VSP2基因的cDNA和基因组序列。根据预测结果，设计简并引物HbVSP2-F和HbVSP2-R（表1），以橡胶树抗病品种（INA873）叶片总DNA 和RNA为模板，采用PCR和RT-PCR方法对基因进行克隆。PCR反应体系为 10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板（30 ng）1 μL，加水补足至25 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测获得目的片段经凝胶回收纯化试剂盒回收连接到pMD18-T载体上送公司测序。

1.2.3 序列分析 利用DNAMAN软件分析目的基因编码的氨基酸序列，ProtParam软件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）预测蛋白质的相关信息。同时，下载近源物种的同源基因氨基酸序列，用MEGA version5.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系统树，用Bootstrap对系统树进行检验，1 000次重复。

1.2.4 表达分析 采用SYBR Green嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR扩增反应，以组成型表达基因18S rRNA做为内参基因，分析HbVSP2基因在橡胶树抗（IAN873）、感（PR107）叶片受多主棒孢病菌（YN49）和外源激素茉莉酸甲酯（0.2 mmol/L MeJA）、水杨酸（0.5 mmol/LSA）、乙烯（0.1% ET）处理后不同时间段（12、24、48、72 h）的差异表达情况。将反转录成cDNA的模板稀释10倍，反应体系为20 μL，参照荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡTli RNaseH Plus（TaKaRa）说明书。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40个循环后作熔解曲线。每个样品均重复3 次，在ABI 7500实时PCR仪上进行，采用2-ΔΔCT法计算分析。2-ΔΔCT=2-[（Ct E-Ct F）-（Ct A-Ct B）]=2（Ct F-Ct B）-（Ct E-Ct A），其中Ct A為处理前待测基因Ct值；Ct B为处理前参照基因Ct值；Ct E为处理后待测基因Ct值；Ct F为处理后参照基因Ct值。表达分析引物为VSP2-QF和VSP2-QR，橡胶树抗、感品种中的选取为本实验室前期研究结果[9]。

1.3 数据分析

试验数据用SPSS 11.5统计软件包中的单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's多重比较进行分析。所有结果均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 目的基因的克隆

分别以橡胶树IAN873的cDNA和DNA作为模板，进行PCR和RT-PCR扩增。扩增产物（图1）经测序和序列分析发现，该基因全长3 509 bp，基因编码区全长975 bp，具有一个完整的开放阅读框，编码324个氨基酸，含有4个内含子和5个外显子（图2），将该基因命名为HbVSP2，其cDNA序列GenBank登录号：KT361645。

2.2 氨基酸序列分析

ProtParam软件预测该蛋白的分子质量为30.01 ku，等电点为4.80。Blastp比对发现，HbVSP2的氨基酸序列与麻风树（XP_012090492）、蓖麻（XP_002510996）、胡杨（XP_011028463）等酸性磷酸酶的氨基酸序列同源性较高，分别达到了86%、85%、和81%。用InterProScan 工具对HbVSP2基因的蛋白质二级结构进行预测，并结合NCBI的结果对其保守结构域进行分析表明，该基因含有植物磷酸酸化酶的保守结构域，是HAD家族蛋白（haloalcanoic acid dehalogenase super family， HAD）中的酸性磷酸酶（图3），具有DXDXT基序特征（图4红色框标示部分），该结构域是HAD超家族中所共有的保守结构域。橡胶树HbVSP2的DXDXT基序位于VSP2的中间部位靠近N端（图4）。

2.3 HbVSP2的系统进化树分析

将HbVSP2基因的氨基酸序列与NCBI数据库中的10种植物VSP2基因的氨基酸序列共同构建系统发育树，结果显示，橡胶HbVSP2基因与麻风树和蓖麻聚在一个大枝上，亲缘关系最近，另外橡胶与同为杨柳科的胡杨，芸香科的柑橘以及无患子科的龙眼亲缘关系也较近，而与蔷薇科的苹果和梅花，以及梧桐科的可可等亲缘关系较远（图5）。

2.4 抗病相关基因的组成型表达特性

通过组成型表达特性来分析发现，HbVSP2在茎的表达量最高，其次是叶片，表达量最低的是根部，此外，在古铜期的表达量为最高，其次是老叶，淡绿期叶片中的表达最低（图6）。说明该基因在橡胶树中存在着明显的组织特异性表达。

2.5 病原菌诱导对HbVSP2基因表达的影响

qRT-PCR结果发现，在多主棒孢病菌（YN49）接种后不同的时间段，与对照相比，HbVSP2基因在抗病品种（IAN873）中的表达量呈极显著升高（p<0.01）。说明接种病原菌能够诱导该基因的表达，但抗、感品种的表达模式有所不同，抗病（IAN873）和感病（PR107）品种在病原菌接种12 h时表达量均达到峰值，且抗病品种的表达量显著高于感病品种（p<0.05），之后在抗病品种中的表达量呈缓慢下降的趋势，至接种72 h时趋于正常；而该基因在感病品种（PR107）24 h时有明显的下调，48 h时又有所上升，到72 h时趋于正常，表达模式不如抗病品种中的有规律（图7）。总之，HbVSP2基因受多主棒孢病菌（YN49）侵染后，均能诱导其表达，且抗病品种（IAN873）的表达量要显著高于感病品种（PR107）（p<0.05）。进一步推测该基因可能与橡胶树和多主棒孢病菌的互作有关，且在抗病品种中的表达量较高，说明该基因在参与橡胶树抗病过程中发挥着一定的作用，但是否与橡胶树的抗病性相关，还有待进一步研究。

2.6 不同外源激素处理后的基因表达

抗病品种（IAN873）受茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、乙烯（ET）3种外源激素处理后均能诱导HbVSP2表达量的升高，但茉莉酸甲酯（MeJA）处理下的表达量明显高于其他2个激素的处理，且在处理后的24 h达到了峰值。而在水杨酸和乙烯处理下的表达量分别在处理后12 h和48 h达到最高，推测该基因在橡胶树中主要参与茉莉酸介导的信号途径（图8）。但不同的外源激素处理之后其表达量有明显的差异，进一步推测，该基因可能参与橡胶树抗病信号转到途径的相关调控，且在不同的信号途径中可能起着不同作用。

3 讨论与结论

项目组前期研究中获得了一个与HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2具有高度同源性的差異表达片段DE-TDFs-24，本研究将该序列与中国热带农业科学院橡胶研究所提供的橡胶树品种‘热研7-33-97基因组序列进行比对，从橡胶树中克隆得到一个VSP2基因，将其命名为HbVSP2。该基因是HAD超家族VSP蛋白的成员，该蛋白是Utsugi等最先从拟南芥中鉴定出来的[10]。序列分析发现，该基因的氨基酸序列与麻风树、蓖麻、胡杨等酸性磷酸酶的氨基酸序列同源性较高，在进化上与麻风树的亲缘关系最近；此外，该基因含有植物磷酸酸化酶的保守结构域DXDXT基序，该结构域是HAD超家族中所共有的结构特征，位于VSP2的中间位置，该结构域决定了VSP2的空间二级结构。相关研究表明VSP2除了在氮储存中发挥重要作用之外，VSP2还具有不同的酶活性，发挥着不同的生理功能。Dewald等[11]证明大豆VSPα和VSPβ同型和异型二聚体具有酸性磷酸酶活性，RuBP羧化酶存在于叶绿体基质中，参与植物光合作用的碳同化。

本研究中HbVSP2受多主棒孢病菌侵染后能诱导其表达量的升高，且抗病品种（IAN873）的表达量明显的高于感病品种（PR107），初步说明该基因在橡胶树与病原菌之间互作过程中发挥作用。而Berger S等（2002）发现vsp1和vsp2 mRNA及蛋白的表达能被昆虫的食草作用诱导，同时用拟南芥fad-3-2，fad7-2，fad8的三突变体来破坏vsp2和其他创伤诱导基因的表达，发现植株对昆虫的侵食变得非常敏感[5]。而乙烯不敏感突变体（ein2， ein3， etr1）具有更高的抗虫性，同时显示出拟南芥VSP积累增加[12-13]，cev1突变组成型表达VSP1和VSP2，具有更高的抗病性[6]。本研究还发现，源激素茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、乙烯（ET）处理后也均能诱导VSP2表达量的升高，茉莉酸甲酯（MeJA）处理下的表达量明显的高于其他2个激素的处理，推测该基因可能参与植物抗病信号传导途径，并且在不同的抗病信号途径中所起到的作用可能不同。Corné等[14]研究证实，VSP2是茉莉酸信号转导途径下游的重要调控因子，且与病原菌发生互作，本研究中茉莉酸甲酯处理和水杨酸结果与病原菌诱导结果较为一致，从而进一步佐证了该基因在橡胶树与病原菌互作过程中发挥作用。

上述研究表明，HbVSP2在橡膠树和病原菌互作过程中发挥着一定的作用，并且在橡胶树抗病品种和感病品种中的表达存在明显的差异，但是是否与橡胶树抗病性相关还需要对其功能和所参与的信号途径进行深入的研究。同时本研究还发现该基因在橡胶树中具有组成型表达的特性发现其在橡胶树根、茎、叶以及古铜、淡绿和老叶中的表达特性均存在一定的差异，这是否与其参与调控抵御病原菌的作用有关还有待进一步的证实。

致 谢 感谢中国热带农业科学院橡胶研究所、农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室对本研究的支持。感谢中国热带农业科学院橡胶研究所、胶乳代谢课题组唐朝荣研究员在HbVSP2基因序列的比对和基因数据的提供方面给予的支持。

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