湖南永州奈李果实一种新病害的病原鉴定

朱欣 谭新球 张德咏 刘勇

摘要：【目的】明确危害湖南永州奈李果实新发生病害的病原物种类，为更好地识别并防控该病害提供理论依据。【方法】用常规分离方法对湖南永州奈李果园发病样品进行病原菌分离，通过形态学特征观察，ITS、TUB、CAL和ACT序列和系统发育进化树分析及致病性测定，对分离获得的病原菌进行鉴定。【结果】分离获得的病原菌形态学特征与大豆拟茎点霉（Phomopsis longicolla）一致；其ITS、TUB、CAL、ACT序列与P. longicolla同源性分别为98%、99%、99%和98%。室内人工接种病原菌3～5 d后果实形成椭圆形至不规则形褐色病斑、后转腐烂等症状，与田间果实危害症状一致。【结论】初步确定危害湖南永州奈李果实的病原菌为P. longicolla YZ。

关键词： 大豆拟茎点霉；奈李；ITS序列；TUB序列；CAL序列；ACT序列

中图分类号： S432.44 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1318-08

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for recognizing and controlling new disease， the pathogen causing new disease of Prunus salicina Lindl. var. cordata Y. He et J. Y. Zhang cv. younai from Yongzhou， Hunan was identified. 【Method】Using conventional isolation method， the pathogen was isolated from diseased fruits of P. salicina collected from orchard of Yongzhou， Hunan. Then， the pathogen was identified based on pathogenicity test， morphological characteristics observation， and analysis of rDNA-ITS， beta-tubulin（TUB）， calmodulin（CAL） and actin（ACT） sequences and phylogenetic tree. 【Result】The morphological characteristics of pathogen were consistent with those of Phomopsis longicolla. ITS， TUB， CAL and ACT sequences analysis showed that the pathogen shared 98%， 99%， 99% and 98% homology with P. longicolla， respectively. Furthermore， the disease symptoms were found on P. salicina fruits within 3-5 d after indoor artificial inoculation， such as first forming elliptic or irregular brown necrosis then rotting， which were in accordance with those of fruits in the field. 【Conclusion】The pathogen is identified as P. longicolla YZ， which can cause new disease of P. salicina.

Key words： Phomopsis longicolla； Prunus salicina Lindl. var. cordata Y. He et J. Y. Zhang cv. younai； ITS sequence； TUB sequence； CAL sequence； ACT sequence

0 引言

【研究意義】奈李（Prunus salicina Lindl.var.cordata Y. He et J. Y. Zhang cv. younai）为蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）果树，素有“李中之王”美称，在我国南方地区大面积种植（马振峰等，2010），是我国特有的名优珍贵经济树种，有重要的经济价值。湖南地区奈李一般3月上中旬开花，7月下旬～8月上旬成熟。2013年6月中旬在湖南永州奈李上发现一种危害奈李果实的真菌病害，由于过往未发生过类似病害，缺乏防治措施，导致园区该病害发病率高达70%，给果农带来了严重的经济损失。因此，对湖南奈李新病害进行鉴定，明确其病原菌种类，对该奈李病害的防治具有重要意义。【前人研究进展】奈李病害发生种类多且危害严重。戴良英和高必达（1993）首次对湖南奈李病害种类进行了系统调查，高必达等（1995）在此基础上对湖南奈李发病情况进行了补充，明确了湖南奈李上共存在30种病害，如炭疽病、细菌性黑斑病、轮斑病等。曹华国等（1997）在江西安远、安义两地奈李产区进行了奈李病害种类调查，结果共鉴定出14种病害种， 其中褐斑病和霜霉病是国内首次报道。大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla）主要引起大豆拟茎点霉茎枯种腐病，是全世界范围内广泛影响大豆生产的一种病原真菌，崔友林等（2010）报道在我国大豆田间首次发现该病害；Shan等（2012）和Chen等（2013）则分别首次在我国南方大豆茎和大豆种子中分离获得该病原物；Shu等（2014）研究表明，在我国自然环境下P. longicolla能够侵染茄子；耿肖兵等（2015）通过形态学鉴定和ITS序列分析首次在大豆苗期根腐病病样中分离到P. longicolla。【本研究切入点】目前已报道的奈李病害症状与湖南永州发现的奈李病害症状存在一定差异，且前人对病原菌鉴定研究主要采取形态学特征结合ITS序列分析的方法。本研究在此基础上进一步结合β-微管蛋白（Beta-tubulin，TUB）、钙调蛋白（Calmodulin，CAL）和肌动蛋白（Actin，ACT）序列进行分析鉴定，这在相似种间鉴定方面更具优势。【拟解决的关键问题】对湖南永州奈李果园发病样品进行病原菌分离纯化，光学显微镜下观察病原菌的形态、分生孢子等生物学特征，并进行致病力测定，结合其ITS、TUB、CAL和ACT序列对病原菌进行鉴定，以明确该病害的病原，为奈李病害防治提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

发病奈李果实采自湖南永州江华瑶族自治县东田镇谢家湾村奈李果园，健康奈李果实购于湖南省农业科学院水果市场，品种均为青奈。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 病原菌分离纯化及培养 用无菌水冲洗病果后用75%酒精清洗3次，用常规分离方法进行病原物分离，接种于28 ℃ PDA培养基上培养并进行单孢纯化3次，获得纯化病原菌，备用。

1. 2. 2 病原菌形态学观察 光学显微镜下观察病原菌菌落特点及分生孢子器、分生孢子大小及形态等特征。

1. 2. 3 DNA提取及扩增

1. 2. 3. 1 病原菌总DNA提取 病原菌总DNA提取采用改良CTAB法：PD液体培养基摇床培养病原菌菌体，28 ℃下200 r/min摇床培养6 d；取200 mg干菌丝液氮迅速研磨后加入3 mL 2% CTAB（w/v）提取缓冲液，65 ℃水浴45 min后4 ℃下4000 r/min离心20 min；取上清液转至离心管中，加入4 μL 10 mg/mL蛋白酶，37 ℃水浴1 h；加入800 μL Tris饱和酚（pH 8.0）混匀，4 ℃ 13000 r/min离心10 min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）混匀，4 ℃ 13000 r/min离心10 min；取上清液，加入RNA酶至终浓度20 μg/mL，37 ℃水浴2 h；加入800 μL氯仿/异戊醇（24∶1）混匀，4 ℃ 13000 r/min离心10 min；取上清液，加入600 μL异戊醇混勻，-20 ℃沉淀30 min后4 ℃ 12000 r/min离心20 min；收集沉淀，75%酒精混匀冲洗，4 ℃ 12000 r/min离心20 min，重复3次，超净工作台真空干燥；取35 μL无菌水溶解DNA，-20 ℃保存备用。

1. 2. 3. 2 PCR扩增及测序 PCR扩增引物共4对，分别为：ITS通用引物ITS4/ITS5（ITS4： 5′-TCCTCCGCT

TATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTGTA

ACAAGG-3′）；TUB引物（Bt2a：5′-GGTAACCAAATC

GGTGCTGCTTTC-3′；Bt2b：5′-ACCCTCAGTGTAGT

GACCCTTGGC-3′）；CAL引物（CL1：5′-GARTWCAAG

GAGGCCTTCTC-3′；CL2：5′-TTTTGCATCATGAGT

TGGAC-3′）；ACT引物（AT1：5′- ATGTGCAAGGCCG

GTTTCGC-3′；AT2：5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCA

T-3′）。PCR反应体系25.0 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）l.0 μL，引物ITS4（10 μmol/L）和ITS5（10 μmol/L）各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，无菌水16.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，ITS（55 ℃）、TUB（58 ℃）、CAL（56 ℃）、ACT（54 ℃）退火45 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物采用l%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪进行观察并拍照。扩增产物割胶回收后连接转化，阳性克隆菌液委托华大生物工程有限公司测序。

1. 2. 3. 3 序列分析与数据处理 测序结果经NCBI BLAST比对，应用MEGA 5.05构建系统发育进化树。

1. 2. 4 致病性测定 取新鲜健康奈李果实，设为A、B、C、D 4组，分别用空白培养基液、菌丝孢子混合液、菌丝和分生孢子悬浮液（孢子液浓度为5×106个/mL）处理，每组5个奈李。处理方法：奈李用无菌水清洗后用75%酒精表面消毒，取固定细针轻微刺扎果表造成伤口，然后用对应接种体液浸润处理，处理后用无菌滤纸移除多余的菌液，置于灭菌玻璃器皿中于恒温箱中28 ℃保湿培养，定期观察记录病害发生发展情况。对接种后发病果实进行病菌再分离，进行形态学验证及ITS鉴定。上述致病性测定试验重复1次。

2 结果与分析

2. 1 田间果实受害症状

发病初期奈李果实出现椭圆形至不规则形黄褐色病斑，随着病情的逐渐蔓延发展，奈李果实病斑逐渐变大，出现黑褐色坏死小点，坏死部分凹陷，后期多个病斑连接形成大面积黄褐色病斑，部分病果腐烂，潮湿环境下能观察到白色菌丝（图1）。

2. 2 病原菌形态特征

病原菌在PDA培养基上培养时产生白色菌丝，气生菌丝棉毛状、致密生长，培养基接种生长迅速，5～6 d即可完全覆盖整个培养皿（图2-A、2-B）；背面初为白色，16 d后逐渐产生埋生、暗褐色至黑色、扩展的子座（图2-C、2-D）；分生孢子器球形、烧瓶形或扁球形，单腔室，具有明显的喙（图2-E）。观察到α型分生孢子，卵圆形至纺锤形，单胞，无色，大小5.41～7.51 μm×2.33～

3.22 μm，两端各有一个油球（图2-F）。未见β型分生孢子，也未见有性世代。

2. 3 序列分析结果

ITS、TUB、CAL和ACT引物进行PCR扩增可分别获得602、557、894和287 bp左右条带（图3），割胶回收及连接转化后，菌落PCR筛选阳性克隆测序。

将供试菌株的ITS、TUB、CAL和ACT序列与GenBank中大豆拟茎点霉茎枯种腐病菌（Phomopsis longicolla）进行同源性比对，其ITS序列（登录号KU517876）与P. longicolla（登录号AY857868.1）ITS序列同源性为98%，TUB序列（登录号KU517878）与P. longicolla（登录号HQ333512.1）TUB序列同源性为99%，CAL序列（登录号KU517877）与P. longicolla[登录号KC343438.1，命名为Diaporthe sojae，根据其发表文章（Gomes et a1.， 2013）确定属于P. longicolla]CAL序列同源性为99%，ACT序列与P. longicolla（登录号KT021552.1）ACT序列同源性为98%；且比对发现病原菌TUB、CAL和ACT序列与P. longicolla以外菌株的同源性均低于94%。根据病原菌ITS、TUB、CAL和ACT序列，选取GenBank BLAST同源性较高菌株及拟茎点霉属部分代表性菌株（表1）构建系统发育进化树（图4），发现病原菌与P. longicolla聚集在同一分支上。根据上述结果，结合病原菌形态学特征，初步确定该病原菌为拟茎点霉属菌株P. longicolla YZ。

2. 4 P. longicolla YZ的致病性测定

选取与发病奈李品种相同的青奈李果实作为试验材料，以P. longicolla YZ的菌丝、分生孢子悬浮液和菌丝孢子混合液3种类型作为接种体，以确定P. longicolla YZ的致病性。结果表明，各接种体的发病时间及侵染力存在明显差异，菌丝孢子混合液对奈李果实具有较强的侵染性，接种1 d后即开始表现症状，且发病症状与田间症状一致，能观察到病斑处有菌丝生长；菌丝接种组发病症状稍轻；分生孢子液侵染力较弱，接种5 d后开始表现轻微症状（表2和图5）。可以推测田间奈李果实病害传播主要以分生孢子和菌丝混合侵染为主。

对室内接种后的奈李病斑进行再分离，纯化的病原物在PDA培养基上培养，其菌落、分生孢子器及分生孢子形态特征与接种前病原物一致；ITS重测测序结果与接种体病原物序列的相似度达99.67%，证明重新分离的病原物与接种体病原相同，可以确定危害奈李的病原为接种病原菌P. longicolla YZ。

3 讨论

本研究从湖南永州病变奈李果实上分离纯化获得的菌株，28 ℃时菌丝生长迅速且能产生较多孢子；病原菌在PDA培养基上生长的形态特征，分生孢子器及分生孢子大小、形态等特征均与崔友林等（2010）和耿肖兵等（2015）所报道的P. longicolla一致。核糖体DNA的转录间隔区（ITS）序列是鉴定真菌属种的一种工具，被廣泛应用于种的鉴定（林剑伟等，2007），ITS结合TUB、CAL和ACT序列用于拟茎点霉属的鉴定，尤其是相似种的鉴定则更具说服力。本研究供试菌株ITS、TUB、CAL和ACT序列通过BLAST比对发现与P. longicolla的ITS、TUB、CAL和ACT序列同源性分别为98%、99%、99%和98%，具有高同源性；结合比对结果中同源性较高的菌种构建系统发育进化树发现，病原菌与P. longicolla聚在同一分支，因此初步确定病原菌是P. longicolla。根据目前相关文献资料，未见P. longicolla侵染奈李报道，在湖南是首次发现P. longi-

colla为害奈李，因此将供试菌株命名为P. longicolla YZ。

与前人对P. longicolla致病性测定研究不同的是，本研究利用菌丝、分生孢子悬浮液和菌丝孢子混合液分别作为不同接种体进行接种，结果显示菌丝孢子混合液接种健康奈李果实2～3 d即表现出明显发病症状，接种后第4 d出现腐烂（相对湿度90%），与田间症状一致，而其他接种体发病症状表现较轻、发病时间滞后，可以推测田间奈李果实病害传播主要以分生孢子和菌丝混合侵染为主。

拟茎点霉属是半知菌亚门、腔孢纲、球壳孢目中的一个重要属，有性态为间座壳属（Diaporthe）（戚佩坤等，2007），其种类繁多、形态特殊、影响广泛（张居念等，2013；李涛等，2015），该属真菌既可以是危害作物的病原菌，又可作用为生防菌应用，越来越多的科研工作者不断加深对拟茎点霉属的研究与应用（王海艳等，2013；康灿昆等，2014；卢松茂等，2015）。尽管拟茎点霉属作为致病真菌具有高度的专化性（李雪光等，2012；张岳平等，2013），但拟茎点霉属真菌危害寄主范围广，包括豆科、旋花科、葫芦科及桃树等；另外，拟茎点霉属P. citri能够侵染柑橘，引起柑橘黑点病（陈国庆等，2010），Diaporthe sp. JTXHS1（Phomopsis sp.的有性态）能够侵染葡萄，引起葡萄树干疾病（Dissana-

yake et a1.， 2014），展现出较强的寄主适应性。而P. longicolla是拟茎点霉属中一个重要的种，可侵染大豆、三叶草、绿豆、豌豆、花生、洋葱、大蒜、辣椒、番茄等（耿肖兵等，2015），拥有较广的寄主范围，高温、高湿、多雨的环境极易导致病害大量发生（张岳平等，2013），与本研究致病性测定结果一致。但是已报道拟茎点霉属每个种的寄主范围尚不完全清楚（姜子德等，2003），因而寄主对其协同进化的影响无法得到确认。本研究的P. longicolla YZ为在奈李上发现的菌株，是否对湖南永州地区柑橘、茶树、葡萄等也具有侵染性还有待进一步研究；此外，该病原菌在我国的危害情况、区域分布和寄主范围等尚不清楚，亦有待进一步探究。

目前对拟茎点霉属引起病害的防治研究相对薄弱（张岳平等，2013），且该真菌引起的病害尚无系统的防治对策，导致果农使用常规化学农药不能达到理想的防治效果，一旦该病害发生极易造成大面积暴发，果农损失严重。化学防治因速效而深受农民欢迎，因此在明确病原菌生物学基础上，需加强化学药剂对该病原菌的防控效果筛选，为指导奈李种植和该病害的防治提供科学依据。

4 结论

本研究结果表明，危害湖南永州奈李果实的新发生病害的病原物属于拟茎点霉属，初步确定病原菌为P. longicolla YZ。

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（責任编辑 麻小燕）