响应面法优化鲅鱼抗氧化肽发酵条件

艾冰花， 艾丽花， 陈　琳， 李秉钧， 冯俊荣， 韩龚文

(1烟台大学海洋学院，山东 烟台 264005；2 烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005；3龙口市水产技术推广站，山东 龙口 265700)



响应面法优化鲅鱼抗氧化肽发酵条件

艾冰花1， 艾丽花2， 陈琳1， 李秉钧1， 冯俊荣1， 韩龚文3

(1烟台大学海洋学院，山东 烟台 264005；2 烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005；3龙口市水产技术推广站，山东 龙口 265700)

摘要：为减少加工废弃物蛋白所造成的环境污染，提高水产品的利用率，探索了回收利用鲅鱼(Spanish mackerel)加工后富含蛋白质的废弃物，以寻找制备鲅鱼抗氧化肽的最佳生产条件。借助Design-Expert数据处理软件对苏云金芽孢杆菌Hy-4发酵产抗氧化肽的条件进行优化；在单因素试验的基础上，利用Plackett-Burman试验设计法对影响发酵制备鲅鱼抗氧化肽的培养条件进行筛选。确定了影响发酵液总抗氧化活性的3个主要影响因素(P<0.5)为发酵温度、培养基初始pH和料液比；在此基础上，利用最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域，再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析，通过求解回归方程得到产抗氧化肽的最优条件为：发酵时间48 h，发酵温度30 ℃，培养基初始pH 6.8，接种量2%，料液比1.45 g/50 mL，菌龄24 h。经过验证，发酵液总抗氧化活性达到537.73 U，较优化前提高了57.2%，与回归方程的预测值570.11 U相比，相对误差为5.7%，说明模型能够较好地预测菌株Hy-4发酵产抗氧化肽发酵液的总抗氧化性。

关键词：鲅鱼；抗氧化肽；发酵；响应面法；总抗氧化活性

鲅鱼(Spanish mackerel)加工废弃物富含蛋白质，采用微生物发酵的方法对其加以利用、制备抗氧化肽，可以提高蛋白质的利用率，减少环境污染[1-2]。多种优化方法已广泛应用于微生物发酵，其中以响应面法的效果最为显著[3]，其特点是可以从众多变量中快速筛选出主要影响因素，避免非重要因素造成时间和资源上的浪费[4]。本研究前期已经筛选出一株具有一定酶解鲅鱼蛋白酶活力的苏云金芽孢杆菌Hy-4，并且发现发酵液中主要是多肽类物质表现出总抗氧化活性。本试验以发酵液经离心过滤制得的抗氧化多肽溶液的粗品为研究对象，采用响应面法，接种苏云金芽孢杆菌Hy-4进行发酵，以寻找优化产抗氧化肽的发酵条件，由此提高生产效率，降低生产成本。

1材料与方法

1.1试验材料

材料与试剂：加工废弃物来自于鲅鱼加工后的边角料(不含鱼头、鳍和内脏)；苏云金芽孢杆菌Hy-4取自本实验室；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，购于天津市致远化学试剂有限公司；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

仪器与设备：LDZM-40KCS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；250HG型数显光照振荡培养箱(金坛市精达仪器制造厂)；H1650-W型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；V-1100D型可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1原料处理及发酵液制备

处理方法根据相关文献[5-9]并稍作修改。(1)原料处理：原料绞碎→烘干(70 ℃，24 h)→打碎→第一次脱脂(乙醇原料比4：1)→第二次脱脂(异丙醇原料比2：1)→烘干(70 ℃，24 h)→过筛网(80目)。种子液培养基制备：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 6.6，120 ℃灭菌30 min。(2)Hy-4号菌优化前发酵条件：发酵时间48 h，温度38 ℃，培养液初始pH 6.6，料液比1 g/50 mL，接种量2%，菌龄12 h。(3)发酵液制备：磷酸缓冲液(pH 6.6，0.05 mol/L)→灭菌(120 ℃，30 min)→接种→发酵→沸水浴灭酶(10 min)→离心(10 000 r/min，20 min)→发酵液。

1.2.2响应面法优化

优化试验中设定6个因素，即发酵时间、发酵温度、培养基初始pH、接种量、料液比及菌龄。以酶解物多肽的总抗氧化性为响应指标，在单因素发酵实验的基础上，先后采用Plackeet-Burman(PB)试验(得到影响效应最大的几个因素)、最陡爬坡试验(以此逼近响应面试验的中心点[10-12])、Box-Behnken(BBD)试验(采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺[13])，最终得到优化后的最佳发酵条件[14]。

1.2.3总抗氧化活性测定

参考吴永沛等[15]的方法，总抗氧化活性(总抗)的测定使用总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒。按照说明书的步骤进行加样，取样量为0.2 mL。计算公式为：

MT-AOC=(A-A0)×(V1/V2)×N×V3×100/30式中：MT-AOC—总抗氧化能力，U；A—测定OD值；A0—对照OD值；V1—反应液总量，mL；V2—取样量，mL；N—样本测试前稀释倍数；V3—发酵液体积，mL。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

在固定发酵温度38 ℃、pH6.6、接种量2%、料液比1 g/50 mL、菌龄12 h的条件下进行发酵试验，考察不同发酵时间对发酵液总抗氧化活性的影响[16]。如图1所示，当发酵时间为48 h时，总抗氧化活性达到最高值。

固定发酵液初始pH 6.6，接种量2%，料液比1 g/50mL，12 h菌龄，发酵时间依单因素发酵时间所得最佳结果为准，即48 h，考察不同发酵温度对发酵液总抗氧化活性的影响。如图2所示，当发酵温度为30 ℃时，总抗最高。

图1　发酵时间对总抗氧化活性的影响Fig.1　Effect of fermentation time on total antioxidant activity

图2　发酵温度对总抗氧化活性的影响Fig.2　Effect of fermentation temperature on total antioxidant activity

固定发酵温度30 ℃，接种量2%，料液比1 g/50 mL，发酵时间48 h，菌龄12 h，考察不同初始pH对发酵液总抗氧化活性的影响。如图3所示，发酵液总抗在初始pH 6.6和7.8时出现高峰，考虑发酵后期pH会上升，因此确定最佳pH为6.6。

图3　发酵培养基初始pH对总抗氧化活性的影响Fig.3　Effect of initial pH on total antioxidant activity

固定发酵温度30 ℃，初始pH 6.6，料液比1 g/50 mL，发酵时间48 h，菌龄12 h，考察不同接种量对发酵液总抗氧化活性的影响。如图4所示，总抗在接种量为2%和6%时分别出现一个峰值(571.15 U，603.74 U)，考虑培养成本，确定2%为最佳值。

图4　接种量对总抗氧化活性的影响Fig.4　Effect of inoculum quantity on total antioxidant activity

固定发酵温度30 ℃，pH 6.6，接种量2%，发酵时间48 h，种龄12 h，考察不同料液比对发酵液总抗氧化活性的影响。图5所示，在料液比为1.25 g/50 mL时，发酵液总抗最高。

图5　料液比对总抗氧化活性的影响Fig.5　Effect of material-solvent ratio on total antioxidant activity

固定发酵温度30 ℃，发酵时间48 h，初始pH 6.6，料液比1.25 g/50 mL，考察不同菌龄对发酵液总抗氧化活性的影响。如图6所示，在种子液菌龄为24 h时，总抗最高。

图6　菌龄对总抗氧化活性的影响Fig.6　Effect of cell age on total antioxidant activity

2.2Plackett-Burman试验结果

基于单因素试验结果，以单因素的最佳值即发酵时间48 h、发酵温度30 ℃、培养基初始pH

6.6、接种量2%、料液比2.5%、菌龄24 h为中心点，分别设置各因素的高值和低值进行PB实验[17]。试验设计及结果见表1。在6个因素中，对发酵液抗氧化活性影响最大的3个因素依次为料液比、温度、初始pH(表2)。由表3可知，方差分析模型的Prob(P)>F值(0.017 3)，表明除去其他3个因素后，所得到的回归方程达到显著水平。

2.3爬坡试验结果

选择料液比、温度和初始pH进行爬坡试验，以三者的效应正负值确定爬坡方向，根据三者的影响大小设计步长[18]。试验设计及结果见表4。发酵液的总抗氧化活性最大值在第4次试验附近，所以选择试验3的设定条件为响应面试验的中心点，进行Box-Behnken试验。

2.4响应面设计与结果分析

从Box-Behnken试验设计及结果(表5)可知，模型显著，回归方程的失拟检验不显著(P=0.540 0>0.05)，说明模型拟合度良好，可以用来描述此组试验数据[19-20]。使用Design-Expert软件对拟合方程进行优化，即去掉AB、A2和B2项，得到编码的拟合方程：

MT-AOC=475.53+8.63A+15.2B+51.76C-27.52AC+28.51BC-19.76C2式中：MT-AOC—总抗氧化能力，U；A—发酵温度，℃；B—料液比，g/50 mL；C—培养基初始pH。

软件预测的最佳发酵条件及总抗氧化性响应值为：发酵温度30 ℃，料液比2.9%，培养基初始pH 6.8，此时的总抗氧化性为570.11 U。

表1　Plackett-Burman试验结果

表2　Plackett-Burman试验效应分析结果

表3　Plackett-Burman试验方差分析结果

注：*表示差异显著(P<0.05)

表4　最陡爬坡试验结果

表5　Box-Behnken试验方差分析结果

注：**表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05)

采用预测的发酵条件，以及单因素中发酵时间、接种量、菌龄的最佳值进行发酵实验，即发酵时间48 h，发酵温度30 ℃，培养基初始pH 6.8，接种量2%，料液比2.9%，菌龄24 h，验证优化后总抗氧化性的预测值。做3个重复试验，每一个重复试验做3个平行，最终得到发酵液总抗氧化性的平均值为537.73 U，与预测值570.11相比，相对误差为5.7%。可见通过响应面法优化可显著提高鲅鱼发酵液抗氧化活性[21]。

胡炜东等[5]使用响应面法优化油莎豆粕蛋白抗氧化肽制备工艺所得到的DPPH自由基清除率，与理论值相比，相对误差为0.44%。陈洁梅等[22]在利用响应面分析法优化豆粕固态发酵工艺生产大豆抗氧化肽的研究中，得到的总抗氧化活性的相对误差为1.16%。相比而言，本研究相对误差较大，这是由于试验材料及试验方法的不同所产生的。本试验采用的是微生物发酵的方法，试验过程的不可控因素很多，试验结果即总抗氧化性的相对误差在10%以内都可被认为误差不大。因此也可以说明本试验响应值的实验值与回归方程的预测值吻合良好。

3结论

以总抗氧化活性为响应值，在单因素试验的基础上，结合Plackeet-Burman试验、最陡爬坡实验和Box-Behnken试验，对发酵产抗氧化肽的发酵条件进行优化研究，最终确定了发酵的最佳条件为发酵温度30 ℃、料液比2.9%、培养基初始pH 6.8，在该条件下，以2%的接种量接种24 h菌龄的菌株Hy-4，发酵48 h，所得到的酶解物抗氧化多肽的总抗氧化活性从优化前的342.02 U提高到537.73 U，增长了57.2%。验证结果与预测值相比，相对误差为5.7%，说明该模型能够较好地预测菌株Hy-4发酵产抗氧化肽发酵液的总抗氧化性。

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Optimization of fermentation conditions of antioxidant peptides from Spanish mackerel by response surface methodology

AI Binghua1， AI Lihua2， CHEN Lin1， LI Bingjun1， FENG Junrong1， HAN Gongwen3

(1SchoolofOcean,YantaiUniversity,Yantai264005,China;2SchoolofLifeScience,YantaiUniversity,Yantai264005,China;3Longkouaquaculturetechnologyextendingstations,Longkou265700,China)

Abstract：In order to improve the utilization efficiency of aquatic products and reduce the environmental pollution caused by waste protein, this paper explored the retrieving and using of Spanish mackerel processing wastes that are rich in protein, thus to search for the optimum conditions for preparing antioxidant peptides from Spanish mackerel, reduce the production cost and improve the economic benefit. Using waste proteins from Spanish mackerel production as substrate and bacillus thuringiensis Hy-4 as fermentation strain, Design-Expert software was applied to optimize the conditions for antioxidant peptides production. On the basis of single factor experiments, Plackett-Burman design was utilized to evaluate the effects of six variables influencing antioxidant peptides preparation from Spanish mackerel, including fermentation time, fermentation temperature, initial pH, inoculum quantity, ratio of material to solvent and cell age. Among the six variables studied, fermentation temperature, initial pH and ratio of material to solvent had significant effects on the total antioxidant activity of fermentation solution (P<0.05). Steepest ascent method was used to approach the optimal region of the total antioxidant activity. The regression analysis was further carried out using Box-Behnken design and response surface analysis. By solving the regression equation, the highest antioxidant peptides production was obtained at fermentation time 48h, fermentation temperature 30 ℃，initial pH 6.8, inoculum quantity 2%, material-to-solvent ratio 2.9%, and cell age 24h. The total antioxidant activity of fermentation solution reached to 537.73U, increased by 57.2% compared to the initial 342.02U. Compared with the predicted value of regression equation 570.11U, the relative error is 5.7%, illustrating that the model can better predict the total antioxidant activity of fermentation solution fermented by Hy-4.

Key words：Spanish mackerel; antioxidant peptides; fermentation; response surface methodology; total antioxidant activity

中图分类号：Q933

文献标志码：A

文章编号：1007-9580(2016)02-056-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.02.011

作者简介：艾冰花(1990—)，女，硕士研究生，研究方向：水生生物学。E-mail：963007166@qq.com通信作者：李秉钧(1961—)，男，教授，研究方向：水产养殖学、遗传育种学、海洋生物技术。E-mail：li6234307@163.com

基金项目：山东省科技发展计划“水产加工废弃物发酵法制取抗氧化肽的研究(2012GHY11515)”

收稿日期：2015-11-05修回日期：2016-03-02