人参皂苷Rh2脂质纳米粒的制备表征及冰片对其抗肿瘤活性的协同作用研究

邹亮　符佳　李维　雨田　郭晓恒　杨林

[摘要]制备人参皂苷Rh2脂质纳米粒，并考察其协同冰片的体外抗肿瘤活性。借助正交设计优化工艺，采用超声辅助溶剂挥发法制备人参皂苷Rh2脂质纳米粒，并对其包封率、载药率、粒径分布、Zeta电位、形态、体外药物释放行为等进行表征，MTT法初步考察其协同冰片的抗肿瘤活性。运用优化工艺制备的纳米乳颗粒圆整均匀，形态良好，3批平均包封率为（773±25）%，载药率为（72±02）%。，体外具有明显的缓释特征，96 h累计释放5242%；人参皂苷Rh2纳米粒作用24，48 h对脑胶质瘤C6细胞体外增殖作用的IC50分别为2233，1146 μmol·L-1，纳米粒配伍冰片后IC50为1636，804 μmol·L-1，并呈现浓度依赖性。

[关键词]人参皂苷；冰片；纳米粒；抗肿瘤

[Abstract]To prepare ginsenosideRh2 lipid nanoparticles， and investigate the synergistic effect with borneol in resisting tumor activity in vitro GinsenosideRh2 lipid nanoparticles were prepared by ultrasonicassisted solvent evaporation method， and orthogonal design was adopted to optimize formulation process Its encapsulation efficiency， drug loading ratio， particle size distribution， Zeta potential， morphology and in vitro drug release behavior were characterized， and synergistic effect with borneol in resisting tumor activity were preliminarily studied by MTT These nanoemulsion particles prepared by the optimized process method were rounding and even in a good shape Encapsulation efficiency and drug loading ratio of three batches of nanoemulsion particles were （773±25）% and （72±02）%， respectively Nanoemulsion particles showed an obvious sustained release characteristics， with 5242% cumulative release within 96 h The killing effect of nanoemulsion particles on glioma cells was dosedependent， with IC50 of 2233 μmol·L-1 and 1146 μmol·L-1 after 24 h and 48 h， respectively After the combination with borneol， the killing effect of nanoemulsion particles on glioma cells was dosedependent， with IC50 of 1636 μmol·L-1 and 804 μmol·L-1 after 24 h and 48 h， respectively

[Key words]ginsenosides； borneol； nanoparticles； antitumor

doi：10.4268/cjcmm20160713

人参Panax ginseng CAMeyer是我国传统名贵中药材，具有大补元气、补气益肺、安神益智的功效，药用历史悠久，素有“百草药王”的美誉，其中人参皂苷是人参中主要有效组分。现代研究表明，人参皂苷具有显著抗肿瘤、抗衰老等药理作用[1]，其中人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）成分是一种次级苷元，具有广谱抗肿瘤作用[25]，其主要作用机制是通过调节免疫功能，抑制肿瘤的浸润和转移、诱导癌细胞凋亡及抑制肿瘤新生血管的形成、逆转肿瘤细胞的耐药性、增强化疗抗癌药物的药效、诱导癌细胞分化并抑制癌细胞生长，还可以预防或减轻化疗的毒副作用等，表现出极强的应用前景。但由于人参皂苷Rh2水溶性差、生物利用度低、易被肿瘤细胞高表达的P糖蛋白外排等特点，极大程度限制其抗肿瘤应用。

近年来，将纳米载体应用于药物抗肿瘤传递研究中，体现出巨大的优势，可显著改善药物水溶性，增加药物在肿瘤组织的蓄积，提高肿瘤细胞中药物浓度，减少药物毒副反应等[6]。目前，纳米乳、脂质体、聚合物胶束、纳米微球等多种纳米形式已广泛应用于中药抗肿瘤活性成分递药研究中，并取得良好效果[7]，但目前还较少有研究对人参皂苷Rh2进行纳米包载和抗肿瘤的研究。脂质聚合物纳米粒[8]是一种新型的纳米载药体系，基于脂质材料与聚合物材料的良好生物安全性，将脂质纳米粒的高稳定性与聚合物内核的优良载药性能相结合，同时具有体内长循环作用和高渗透长滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR effect）。但由于存在血脑屏障，导致游离药物或者脂质纳米粒都很难进入脑部病患，目前化疗手段对于脑部病变的治疗效果仍有限，以脑胶质瘤为代表的脑部疾病治疗缺乏有效的递药手段。

冰片是龙脑香科植物龙脑香树脂的提取物，《本草纲目》记载冰片有“引药上行”之功效，在许多中成药中作为“药引”，可以促进药物跨过血脑屏障，作为脑部病变的引经药，应用于脑靶向给药系统[911]。目前研究表明冰片与药物或纳米载药复合物共用具有促进药物入脑递送的作用[1213]。本研究针对人参皂苷Rh2游离形式在水溶性和抗肿瘤作用的不足，采用脂质聚合物纳米粒将其包载于内核，得到具有核壳结构的纳米递药系统，用以抗脑胶质瘤，并与冰片协同给药，以增强抗脑胶质瘤细胞作用。通过考察人参皂苷Rh2包载工艺、理化性质和协同冰片后纳米粒的体外抗细胞增殖作用，研究其作为脑胶质瘤治疗给药手段的可能性。

1材料

METTELER AE200S型电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；RTElite恒温磁力搅拌器（美国Thermo Scientific公司）；NanoZSP 纳米粒度电位分析仪（英国 Malvern仪器有限公司）；MillQ 超纯水仪（美国Millpore公司）；H600型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；FH100型恒流蠕动泵（美国Thermo Scientific公司）；SpectraMax M5 酶标仪（美国 Molecular Devices 公司）。

人参皂苷Rh2（纯度≥98%，成都曼斯特公司）；（+）冰片（纯度≥98%，大连美仑生物技术有限公司）；PEG2000DSPE聚二乙醇修饰磷脂（西安瑞禧生物科技有限公司）；PLGA聚（乳酸羟基乙酸）共聚物（山东岱罡生物制品公司）；蛋黄卵磷脂（SIGMAALDRICH 中国）；脑胶质瘤C6细胞株（中国科学院上海细胞研究所）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；DMEM 高糖培养液（武汉博世德生物医药技术有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2方法

21人参皂苷Rh2含量测定采用Waters e2695 HPLCUV测定人参皂苷Rh2含量。色谱柱Waters C18柱（46 mm×250 mm，5 μm），柱温25 ℃，检测波长203 nm，流动相水乙腈（40∶60），流速10 mL·min-1。精密称取人参皂苷Rh2对照品适量于量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度配成储备液01 g·L-1。分别精密吸取一定量储备液配制成100，50，25，125，625，3125 mg·L-1系列质量浓度的对照品溶液，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，得线性回归方程及线性关系，并考察日间和日内精密度。

22脂质聚合物纳米粒的制备采用超声辅助溶剂挥发法制备纳米粒。将一定量蛋黄卵磷脂与PEGDSPE溶于少量无水乙醇中，缓慢滴加入温水（水相）中，持续搅拌一段时间，另将人参皂苷Rh2与PLGA材料共溶于乙腈（油相）中，超声后缓慢滴加入脂质水溶液中，冰浴超声再持续搅拌一段时间，采用旋转蒸发仪减压除去残余有机溶剂，过045 μm滤膜，除去未包载药物，再过022 μm滤膜灭菌，得均匀的泛乳光纳米溶液。

在单因素试验基础上，选取蛋黄卵磷脂与PEGDSPE比例、人参皂苷Rh2与PLGA材料比例、油相和水相体积比为考察因素，选取包封率和载药率为综合评价指标，权重系数均为05，采用正交设计优化制备工艺。

23脂质聚合物纳米粒的表征取适量纳米粒溶液（1 g·L-1）滴于铜网上，静置10 min后用滤纸片吸干，再滴加20%磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，自然挥干，用透射电子显微镜观察纳米粒形态。采用激光粒度测定仪测定纳米粒平均粒径和 Zeta 电位。

基于微孔滤膜过滤法除去游离药物，分别吸取等体积过滤前后的纳米溶液，根据体积1∶1加入乙腈超声使其破乳溶解，并定容至刻度，稀释至合适质量浓度，于1万 r·min-1离心10 min，经022 μm微孔滤膜滤过，测定其中人参皂苷Rh2含量，即分别得到纳米粒中药物含量和投药总量。包封率=纳米粒中药物质量/投药总质量×100%。

将上述过滤后纳米粒溶液冻干，精密称重，即得到过滤后纳米粒中药物与载体材料的总量。载药率=纳米粒中药物质量/（纳米粒中药物质量+载体材料质量）×100%。

24脂质聚合物纳米粒的体外药物释放用透析法测定纳米粒中包载人参皂苷Rh2的体外释药特性。将分子截留量3 500的透析袋煮沸并置于蒸馏水中浸泡超过24 h。分别取2 mL纳米粒溶液和游离药物溶液（人参皂苷Rh2溶解于乙醇与聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）置于透析袋中，两端扎紧，置于37 ℃ 40 mL含01%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）的PBS液中，并以 300 r·min-1磁力搅拌器不断搅拌，分别于025，05，1，2，4，8，12，24，48，72，96 h吸取透析袋外部溶液1 mL，每次补充等量的接收液。HPLC测定不同时间点接收液中药物浓度，计算药物的含量，推算得累积释药百分数。

25细胞培养C6细胞培养于DMEM培养基（含45 g·L-1葡萄糖、37 g·L-1碳酸氢钠、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素）。培养条件：37 ℃，5% CO2和饱和湿度90%。

26脂质聚合物纳米粒配伍冰片的抗脑胶质瘤细胞增殖作用分别取生长状态良好并处于对数生长期的鼠源胶质瘤C6细胞，用025%胰蛋白酶EDTA液消化，并反复吹打制备成单细胞悬液，将细胞悬液的浓度调整为5×104个/mL接种于96孔板，每孔体积100 μL然后将培养板移入培养箱中，37 ℃，5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h至细胞贴壁后，吸去培养基。采用无血清培基分别稀释游离空白纳米粒、冰片、人参皂苷组分、人参皂苷纳米粒、纳米粒+10 μmol·L-1冰片等组至不同药物浓度，随后按浓度梯度在各孔中分别加入稀释后样品各100 μL，空白培养基作为对照，每组重复6孔，分别培养24，48 h后吸去培养基，各孔加入100 μL培养基稀释的MTT溶液，孵育4 h，再加入100 μL DMSO溶解生成的甲瓒，通过酶标仪（570 nm）检测细胞增殖活力。

3结果

31纳米粒药物包载工艺的考察试验中由于不溶于水的游离人参皂苷Rh2经滤膜已被除去，而溶于水的部分因人参皂苷Rh2在水中溶解度低，与载入聚合物纳米粒中质量相比，可忽略不计[1415]，故计算包封率及载药率时，人参皂苷Rh2溶于水的部分不考虑在内。根据预试验发现各因素水平对粒径影响较小，故以包封率和载药率为评价指标，因素水平见表1，实验安排及结果见表2，方差分析见表3。

由直观分析可知，各因素对制备工艺的影响顺序为B>A>C。方差分析结果表明，因素B对综合评分有显著性差异，而因素A和C对评分影响无显著性差异，故确定最优工艺组合为A3B3C2，即卵磷脂和PEGDSPE比例为3∶1，Rh2与PLGA比例为1∶3，油水相体积比例为1∶5。

按照最佳处方和工艺条件制备Rh2脂质聚合物纳米粒，进行3次重复试验，结果其包封率为（773±25）%，载药率为（72±02）%。

32载药纳米粒的质量评价微孔滤膜过滤前的液态体系带淡蓝色乳光，略浑浊，有肉眼可见的细小微粒悬于其中，静置2 h内均析出细小沉淀，振摇后不能均匀分散。而经022 μm微孔滤膜过滤后液态体系为泛淡蓝色乳光的、均匀的半透明胶体溶液，无肉眼可见细颗粒，静置72 h后无沉淀析出。

通过透射电镜可观察到载药微粒大部分成规则的球形，表面基本光滑，大小基本均匀，纳米粒之间基本无粘连；采用激光散射仪测定其载药纳米粒平均粒径为（964±36） nm，PDI为024±006，电位为（-86±06） mV，见图1。

33载药纳米粒的体外释药行为人参皂苷Rh2从游离溶液中快速释放，在24 h之内即达到释放平衡，总释药量达92%，见图2。而载药纳米粒的释放则更加缓慢，其释放曲线可分2个阶段：突释阶段和稳定释放阶段。在突释阶段中，微粒释放药量在24 h内达到3964%，随后在扩散阶段持续时间最长，释药量保持稳定增长，96 h累积释药量达到5242%，并呈逐渐上升趋势。

34载药纳米粒的抗脑胶质瘤细胞增殖作用人参皂苷Rh2不同形式在系列浓度下不同作用时间对脑胶质瘤C6体外增殖作用的影响，结果见图3，4。图3结果显示，空白材料和游离冰片对C6细胞的增殖无明显抑制作用。由图4结果可知，3种人参皂苷Rh2给药形式对C6细胞增殖均呈抑制作用，并呈现浓度和时间依赖性，且在各个时间点的抗细胞纳米微球[19]，人参皂苷Rg固体脂质纳米粒[20]等。本实验采用超声溶剂挥发法制备脂质聚合物纳米粒用以包载人参皂苷Rh2。在制备工艺中，随其PLGA聚合物浓度的不断增加，单位质量纳米粒可包裹更多的人参皂苷，但辅料的增加可能造成载药量降低，所以综合评分中选择包封率及载药量作为评价指标。而制备过程随水相体积增加，包封率及载药量均降低，原因可能是水相体积增加，有机相扩散到水相的速度加快，而聚合物包载于脂质层需要一定时间，药物来不及被聚合物包载便随有机相扩散到水相中，故包封率及载药量均降低，综合评分降低。

人参皂苷Rh2口服生物利用度很低，其主要原因包括口服后经胃肠道吸收的药量少；易被消化道的酶或微生物分解；肝脏的首过效应明显。将人参皂苷Rh2制成脂质聚合物纳米粒后，有望将其制备作为口服给药。载药纳米粒经口服后，可利用脂质层的粘附性增加载药粒子在肠道的停留时间和接触面积，改善药物在肠道中的分布和传递，提高口服生物利用度。同时，药物经包裹后释药缓慢，同时纳米粒核壳结构可保护药物免受胃肠道消化酶的降解，并实现缓慢持续地释放药物，促进药物的肠道吸收。

研究结果证实，以脂质聚合物纳米粒为载体包载人参皂苷Rh2后能有效增加成分的水溶性，其粒径分布均一，形态圆整，并且具有药物缓释特征，同时体外研究表明纳米粒可增加对脑胶质瘤细胞增殖抑制作用。冰片可迅速透过血脑屏障，具有“独行则势弱，佐使则有功”、“芳香走窜，引药上行”的特点，适宜与他药配伍。许多中成药，如安宫牛黄丸、麝香保心丸和冰硼散等都有冰片的配伍应用。本实验将冰片与人参皂苷Rh2纳米粒配伍使用以期增加纳米粒抗脑部肿瘤效果，结果表明，联合给药后人参皂苷纳米粒的抗肿瘤作用显著增加，说明这种给药方式可能作为抗脑部肿瘤的有效药物传递途径。

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[责任编辑孔晶晶]