含水量对川牛膝种子活力的影响及其抗老化机制分析

王倩　杨梅　裴瑾　王黎　吴沂芸　吕烩

[摘要]以川牛膝Cyathula officinalis种子为材料，通过高温高湿法进行人工加速老化，研究9个含水量对川牛膝种子活力的影响，并对不同含水量的抗老化机制进行了分析。研究结果表明，人工老化后，种子活力普遍有所降低；总体而言，含水量655%～478%的种子活力及抗老化能力相对较强，种子电导率值、POD活性、MDA含量升高幅度均较小，脱氢酶和SOD活性降低幅度亦较小；且在种子含水量577%时，未老化种子发芽试验各指标最高，人工老化和未老化的种子POD活性均最低，浸出液电导率较低，脱氢酶、SOD活性均最高，CAT活性亦较高。因此，在对川牛膝种子进行低温种质库保存时，为使其保持较高的活力和抗老化能力，应考虑将含水量降至接近（570±1）%。

[关键词]川牛膝；含水量；人工老化；种子活力；抗老化机制；低温种质库保存

[Abstract]Effects of nine different moisture contents on vigor of Cyathula officinalis seeds and its antiaging mechanism were studied by artificial accelerated aging through high temperature and wet The research results showedthat seed vigor were generally decreased after artificial aging； in general， seed vigor and its antiaging ability are relatively stronger within the scope of 655%478% moisture content， the increase range of seed conductivity， peroxidase activity， malondialdehyde content，and reduce amplitude of activityof dehydrogenase ， superoxide dismutaseare alllower as well And when the moisture content reduced to 577%， all of the germination tests index of the nonaged seeds are the highest， and the activity of peroxidase the lowest，conductivity of leaching solution relatively low， activity of dehydrogenase and superoxide dismutase the highest，and catalase activityrelatively highTherefore， in the low temperature germplasm preservation of C officinalis seeds， the seed moisture content should be controlled close to the range of （570±1）% to keep higher vigor and antiaging ability

[Key words]Cyathula officinalis； moisture content； artificial aging； seed vigor； antiaging mechanism； low temperature germplasm preservation

doi：10.4268/cjcmm20160711

川牛膝，来源于苋科杯苋属多年生草本植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，为临床常用中药，以种子繁殖为主。种子活力是种子质量的重要指标和种用价值的重要组成部分，老化是种子在贮藏过程中普遍存在的一种现象，可影响种子活力和寿命。良好的贮藏环境可减慢种子的老化速度，对于川牛膝等以种子繁殖为主的药用植物种子的保存而言，低温种质资源库是最简便、最经济、应用最普遍的方法[1]。在低温种质库贮藏条件下，含水量是影响种子活力的关键因素之一[2]。自然状态下，短时间内不易得到不同程度的老化种子，通过人工老化[34]的方法可以解决这一问题，从而在较短的时间内了解种子活力变化，预测其耐贮藏情况。本试验以川牛膝种子为研究对象，以期确定其低温种质资源库中保存的最佳含水量，为其低温长期保存关键技术及后续国家中药种质资源库（成都）的运行提供参考。

1材料

供试材料为2014年11月于四川乐山金口河收获的川牛膝种子，经成都中医药大学裴瑾教授鉴定为苋科杯苋属植物川牛膝C officinalis的种子。试验前将种子保存于国家中药种质资源库的低温种质库中。参照《农作物种子检验规程》（1995）含水量测定方法，将初始含水量1125%的川牛膝种子，在电热鼓风干燥箱中（50 ℃）烘干至含水量分别为712%，655%，605%，577%，520%，478%，425%，375%。将不同含水量的种子分成2份，一份进行人工老化（高温高湿法）后铝箔纸袋密封保存，另一份直接铝箔纸袋密封保存。

2方法

21发芽试验参考张祎楠[5]的发芽试验方法。以滤纸为发芽床，发芽温度设定为25 ℃，培养皿水分为70%，光照条件为8 h光照/16 h黑暗。首次计数时间为第2天，末次计数时间为第10天，每份材料重复3次，每次重复随机取不同含水量的川牛膝种子100粒进行发芽，胚轴长度达到真种子自身长度时计为发芽。统计萌发情况，计算发芽率、发芽势和发芽指数。

发芽率=最终发芽种子数/供试种子总粒数×100%

发芽势=规定时间内的发芽种子数/供试种子总粒数×100%，本实验以第7天作为计算发芽势的时间。

发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt），Gt为在第t天的发芽数，Dt为对应的发芽天数。

22浸出液电导率测定参考文献[6]的方法。取不同含水量的川牛膝干净种子各200粒于烧杯中，加100 mL去离子水，以去离子水作对照，20 ℃浸泡24 h，然后取出种子采用DDSJ308A电导率仪测定种子浸出液和对照组的电导率。

23过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法[7]。以愈创木酚为底物，酶液用磷酸二氢钾溶液分离提取，加pH 60的磷酸缓冲液，以反应混合液3 mL和KH2PO4 1 mL为对照，测定在470 nm波长下吸光度，每分钟吸光度变化表示酶活性大小。

24丙二醛（MDA）含量测定参考朱诚等[8]的方法，结合硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定丙二醛含量。取不同含水量的川牛膝种子各05 g，加2 mL 10%的三氯乙酸溶液，研磨成匀浆，再加8 mL三氯乙酸溶液进一步研磨，取匀浆经4 000 r·min-1离心10 min。取上清液2 mL，加2 mL 06%的硫代巴比妥酸溶液，在沸水上水浴15 min，迅速冷却后离心，取上清液测定532，600，450 nm波长下的吸光度。

25脱氢酶活性测定（TTC定量法）将不同含水量的川牛膝种子在25 ℃恒温中发芽72 h后，随机取萌发种子20粒，重复3次。将种胚剥出，放入试管中，加入04%氯化三苯基氮唑（TTC）溶液和磷酸缓冲液（pH 7）各5 mL，使种胚充分浸没在溶液中，在37 ℃保温2 h，取出后立即加入浓度为1 mol·L-1的硫酸2 mL以终止反应。将样品吸干水分后放入研钵中，加乙酸乙酯4 mL充分研磨后以3 000 r·min-1离心5 min，将上清液移至10 mL刻度试管中，加乙酸乙酯定容并摇匀。以乙酸乙酯为对照，取提取液在A580型双光束紫外可见分光光度计485 nm波长下测定吸光度，由标准曲线查出相应的TTC还原量，定量计算脱氢酶活性。

26总超氧化物歧化酶（TSOD）活性测定（试剂盒法）测定原理：试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O-·2），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，550 nm测定其吸光度；当被测样品含SOD时，可专一性抑制超氧阴离子自由基，使其形成的亚硝酸盐减少，吸光度降低，通过公式即可计算样品中总SOD的活性。本研究以不同含水量川牛膝种子发芽1周的子叶为材料。

27过氧化氢酶（CAT）活性测定（试剂盒法）测定原理：过氧化氢酶分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，于405 nm处测定其变化量，可计算出CAT活性。本研究以不同含水量川牛膝种子发芽1周的子叶为材料。

3结果与分析

31发芽试验未老化川牛膝种子发芽率、发芽势及发芽指数均随其含水量的降低总体呈现先上升后下降的趋势，含水量577%时，各项种子活力指标均表现为最高水平。人工老化处理后，种子活力除在含水量478%时较低外，其余含水量对应活力指标均无显著变化且保持在较高水平；种子活力在712%～425%均低于未老化者，其中以含水量52%的种子活力下降幅度最小，含水量478%时的下降幅度最大，见图1～3。

32电导率的测定高活力的种子细胞膜完整性好，浸入水中后渗出的可溶性物质或电解质少，浸出液的电导率低；反之，则高。当种子含水量高于577%时，未老化和人工老化的种子电导率均随含水量的降低先上升后下降，均以含水量577%时的电导率较低；当含水量低于577%时，电导率均再次出现不同程度的升高。人工老化后，种子电导率在含水量577%～478%的升高幅度随含水量的降低而减小，含水量为425%时的升高幅度最大，见图4。

33过氧化物酶（POD）活性的测定人工老化和未老化种子的POD活性随种子含水量的降低均呈现先下降后上升的趋势，其中含水量577%时，POD活性均最低。在605%～478%含水量，未老化种子的POD活性无明显变化且保持在较低水平；含水量高于605%时，种子POD活性随含水量的降低出现明显下降；含水量低于478%时，种子POD活性随含水量的降低而显著升高。经过人工老化处理后，种子POD活性较未老化种子出现不同程度的升高；在655%～52%的含水量，POD活性的升高幅度较小并保持在较低水平，且以含水量577%时POD活性的升高幅度最小，见图5。

34丙二醛（MDA）含量的测定种子在老化过程中，会发生膜质过氧化作用，丙二醛（MDA）是其产物之一，丙二醛含量越高，种子活力越低，反之亦然。未老化和人工老化的川牛膝种子浸出液MDA含量随种子含水量的降低整体均呈现上升趋势，含水量577%为2种处理下MDA含量明显上升的拐点。人工老化后，MDA含量在含水量712%～375%时均高于未老化组，且在655%～478%，MDA含量升高幅度较小，含水量为425%时的升高幅度最大，见图6。

35脱氢酶活性的测定脱氢酶与种子呼吸作用中的能量化合物密切相关，其活性越高，种子活力越高，反之亦然。人工老化处理种子和未老化种子的脱氢酶活性随着其含水量的降低总体均呈现先上升后下降的趋势，以含水量577%时的脱氢酶活性均最高，含水量1125%时最低。人工老化后，含水量712%～375%，脱氢酶活性均有所降低；在712%～605%，478%～375%含水量的脱氢酶活性降低幅度均随含水量降低而增大；含水量605%～478%时，脱氢酶活性随含水量降低而减小，见图7。

36总超氧化物歧化酶（TSOD）活性的测定超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧阴离子自由基（O-·2），保护细胞免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其活性越高，种子活力则越高，反之亦然。人工老化后，多数种子的超氧化物歧化酶活性有所降低；在含水量605%～425%，2种处理的种子的总超氧化物歧化酶活性均随含水量的降低呈现先上升后下降的趋势，且此范围内的酶活性均以含水量577%时最高；含水量577%～478%的酶活性降低幅度较小，见图8。

37过氧化氢酶（CAT）活性的测定过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，是重要的保护酶之一，其作用是清除代谢中产生的H2O2，以避免H2O2积累对细胞的氧化破坏作用，因而，其活性越高，种子活力越高。老化后，大多数种子的过氧化氢酶活性有所降低，但与老化前的酶活性相差不大；含水量605%，577%时，种子酶活性均较高，且含水量605%时，过氧化氢酶活性降低幅度较小，见图9。

4讨论

41含水量对川牛膝种子活力的影响以收集保存种子为主题的低温种质库是当今保护植物种质资源最为普遍且可靠易行的方式，适当降低含水量可使种子在低温或超低温的情况下保持很好的活力[9]。目前，种子活力的测定方法有很多，其中国际种子检验协会（ISTA）推荐使用的方法为电导率法和加速老化法[10]。本研究采用人工加速老化法研究了9个含水量对川牛膝种子活力的影响，测定了种子发芽指标、种子浸出液电导率、MDA含量、POD、脱氢酶、总SOD及CAT活性。结果表明，人工老化后，种子活力普遍有所降低，种子电导率在577%～478%含水量的升高幅度较小，POD活性在655%～52%含水量时的升高幅度较小并保持在较低水平，MDA含量在655%～478%升高幅度较小，脱氢酶活性降低幅度在含水量605%～478%时随含水量降低而减小，总SOD活性在含水量577%～478%时下降幅度较小，CAT活性在含水量605%时较高且老化后的降低幅度较小。总之，在含水量655%～478%，川牛膝种子抗老化能力较强，种子活力较高。且在种子含水量577%时，未老化种子发芽试验各指标均为最高，2种处理的种子POD活性均最低，浸出液电导率较低，脱氢酶、总SOD及CAT活性均较高。因而，后续对于川牛膝种子低温种质库中保存最佳含水量的确定可在（570±1）%进行进一步的筛选研究。

42含水量对川牛膝种子的抗老化机制分析

目前，关于种子活力丧失的机制尚不完全清楚，但膜脂过氧化和自由基被认为是主要原因[11]。膜脂过氧化，膜透性增加，溶质外渗，合成能力下降，激素也发生变化，保护性酶的活性降低，清除自由基及过氧化物的能力减弱；自由基不断积累，攻击膜磷脂分子的不饱和脂肪酸，膜被破坏，透性增大，MDA等有毒物质积累[12]，造成种子活力下降。种子中的水分依据其存在状态分为游离水、结合水及中间过渡类型，其中，游离水的多少直接关系到种子的生理生化过程，从而影响种子品质与贮藏寿命。本研究中，适当降低含水量可减缓种子老化程度，可能即是因自由基活跃程度受自由水（游离水）含量影响[11]的缘故。

本研究中，人工老化后的种子POD活性较未老化种子均出现不同程度的升高，这与已报道文献[1314]研究结果不一致。究其原因，可能与POD不仅具有清除自由基、保护细胞的作用[15]，也能使某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度[16]，并可能具有生长素氧化酶的性质[17]有关，从而导致在老化种子中活性较高。因而，本研究对超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）亦进行了活性测定，结果表明，2种酶在老化种子中的活性普遍有所降低。由2种酶的测定原理可知，二者可分别通过专一性地抑制超氧阴离子自由基（O-·2）自由基和清除H2O2达到保护种子活力的作用，且二者活性在577%～478%含水量抗老化作用较强，进一步佐证了前述种子活力丧失机制的观点[1112]。因此，对于低温种质库中种子的保存而言，最佳含水量的研究不可或缺。

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[责任编辑吕冬梅]