HPLC睧LSD同时测定不同产地醉鱼草果实中3种三萜皂苷的含量

吴培云　任亚硕　吴德玲　乔金为

[摘要]建立了HPLCELSD测定醉鱼草果实中三萜类成分含量的方法。采集不同产地醉鱼草果实药材共9批，采用反相高效液相色谱蒸发光散射检测法测定其三萜成分。色谱条件：Waters SunFireTM C18柱（46 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇水（82∶18）溶液，体积流量1 mL·min-1，柱温30 ℃。ELSD参数：漂移管温度106 ℃，喷雾温度50 ℃，载气（N2）流速15 L·min-1，增益系数1。结果表明醉鱼草果实中的3种三萜成分clinoposaponin Ⅲ， desrhamnoverbascosaponin， mimengoside Ⅰ的进样量分别在0702～2808 μg（r=0999 2），0390～1560 μg（r=0998 9），0192～768 μg（r=0999 0）呈良好线性关系；平均加样回收率（n=6）分别为9941%，9908%，9867%，相对标准偏差分别为086%，16%，18%。该方法简便、准确、可靠，适用于测定醉鱼草果实中三萜类成分的含量。

[关键词]醉鱼草；三萜；HPLCELSD；含量测定

[Abstract]To establish an HPLCELSD method for the quantification of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana The RPHPLCELSD method was used for the determination of triterpenoids in B lindleyana fruits， which were collected from different habitats The column used was a packed with 5 μm stationary phase Waters SunFireTM C18（46 mm×150 mm， 5 μm） The mobile phase consisted of Methanolwater（82∶18） at a flow rate of 1 mL·min-1 Column temperature： 30 ℃ ELSD conditions： drift tube temperature： 106 ℃； carrier gas （nitrogen） flow rate： 15 L·min-1； amplification factor： 1 The calibration curves showed good linear relationship on a range from 0702 to 2808 μg（r=0999 2） for Clinoposaponin III， 0390 to 1560 μg（r=0998 9） for Desrhamnoverbascosaponin and 0192 to 768μg（r=0999 0） for Mimengoside I The average recovery rate（n=6） were 9941%， 9908% and 9867% and it′s RSD were 086%， 156% and 180% This method can be used to determine the contents of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana for its simplicity， accurateness and reliability

[Key words]Buddleja lindleyana； triterpenoids； HPLCELSD； determination of content

doi：10.4268/cjcmm20160710

醉鱼草果实药材为马钱科Loganiaceae植物醉鱼草Buddleja lindleyana Fortune的果实，具有祛风除湿、止咳化痰、散瘀之功效[1]。课题组通过对醉鱼草果实的系统研究发现，醉鱼草果实分离所得的单体化合物中，三萜及其苷类占绝大多数，且具有一定的神经细胞保护活性[24]。为了加强对醉鱼草资源的综合开发利用，本文对采集自万佛山、天柱山、歙县3个不同产地醉鱼草果实中齐墩果烷型三萜皂苷的含量进行了测定。

三萜类成分的含量测定一般采用香草醛冰醋酸、高氯酸显色法，本课题组前期已建立了紫外分光光度法测定醉鱼草果实中总三萜含量的方法[5]，虽可为醉鱼草果实中三萜含量的测定提供参考，但该方法准确度不高，专属性较差，有一定的局限性，考虑到醉鱼草果实中的三萜成分紫外吸收不强，本实验选用通用型蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD）。本文首次报道了HPLCELSD[67]测定醉鱼草果实中三萜成分的含量，并对不同产地的醉鱼草果实药材进行分析，以期为醉鱼草的质量研究提供参考。

1材料

11仪器美国Agilent 1260高效液相色谱仪（二元泵 G1312C，柱温箱 G1316A；自动进样器 G1329B，检测器 380ELSD）；分析天平（瑞士METTLER TOLEDO AB135S）；高速中药粉碎机（浙江省温岭市百乐粉碎设备厂 FZ02型）；超声清洗仪（天津奥特塞恩斯 AS3120）；一体式超纯水系统（德国默克密理博MilliQ）。

12试药clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengoside Ⅰ的对照品均从醉鱼草果实提取物中分离得到，并由现代波谱技术鉴定了其化学结构，见图1。用归一化法测得3种对照品纯度均大于98%；甲醇为色谱纯，水为实验室自制超纯水，其余试剂均为分析纯。醉鱼草果实药材分别采自安徽舒城万佛山（2012年11月）、潜山天柱山（2013年9月）以及歙县（2013年11月）地区，经安徽中医药大学药学院刘守金教授鉴定为马钱科植物醉鱼草B lindleyana的果实。

2方法及结果

21对照品溶液的制备精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的化合物clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengoside Ⅰ对照品2633，1462，721 mg，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，得质量浓度为1053，0585，0288 g·L-1的对照品溶液，然后将此3个对照品溶液按1∶1∶1混合，即得质量浓度分别为0351，0195，0096 g·L-1的混合对照品溶液。

22供试品溶液的制备精密称取不同产地醉鱼草果实粗粉2 g，置50 mL圆底烧瓶中，加80%乙醇20 mL回流提取3次，每次1 h，合并滤液，转移置100 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得供试品溶液。

23色谱条件与系统适用性试验色谱条件：Waters SunFireTM C18柱（46 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇水（82∶18）溶液，体积流量1 mL·min-1，柱温30 ℃。ELSD参数：漂移管温度106 ℃，喷雾温度50 ℃，载气（N2）流速15 L·min-1，增益系数1。在色谱条件下，取供试品溶液、对照品溶液分别进样20 μL，3种成分均能与其他组分达到基线分离，对照品溶液及供试品溶液的HPLC色谱图见图2。

24线性关系考察对照品溶液采用自动进样器进样，进样量依次为2， 5， 10， 20， 40， 60， 80 μL，按照23项下的色谱条件测定峰面积，以对照品进样量（μg）的常用对数为横坐标X，色谱峰面积值的常用对数为纵坐标Y，绘制标准曲线。得线性回归方程见表1。

25精密度试验对照品溶液采用自动进样器精密吸取20 μL，连续进样6次，测定峰面积。得出clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ对应峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）分别为088%，096%，16%，说明仪器精密度良好。

26重复性试验按22项方法制备6份供试品溶液，分别进样20 μL，测定clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的色谱峰面积，计算平均质量分数分别为2152%，0806%，0194%，RSD（n=6）分别为12%，10%，20%。表示该方法测定这3种三萜含量的重复性良好。

27稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12 h自动进样20 μL，测定clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的对应色谱峰面积，计算RSD（n=5）分别为12%，084%，14%，说明供试品溶液在12 h内基本稳定。

28加样回收率试验精密称取万佛山产地的醉鱼草果实粗粉9份（3种三萜质量分数分别为2152%，0806%，0194%），每份10 g，分别向其中加入低、中、高3种质量浓度的对照品溶液（分别相当于药材原有含量的50%，100%，150%），每一质量浓度取3份，按22项方法制备供试品溶液，得6份加标溶液。采用自动进样器分别精密进样20 μL，计算加样回收率。结果得clinoposaponin Ⅲ的加样回收率为9941%，RSD 086%；desrhamnoverbascosaponin的加样回收率为9908%，RSD为16%；mimengosideⅠ的加样回收率为9867%，RSD 18%，结果见表2，实验证明，加样回收率良好。

29样品含量测定取不同产地的醉鱼草果实（万佛山、天柱山、歙县），按22方法进行操作，分别制成供试品溶液，同一批次平行测定2份。在23色谱条件下各进样20 μL，测定不同产地醉鱼草果实中clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ的平均含量（n=3），结果见表3。

从试验得出的数据进行分析得出，不同产地的醉鱼草果实中三萜成分的含量存在差异，以天柱山产地的clinoposaponin Ⅲ含量较高，而万佛山产地的desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ含量较高。本实验建立的HPLCELSD法测定3种三萜皂苷的含量，可以在一定程度上反映出醉鱼草果实中三萜类成分的总含量。

3讨论

本实验在课题组前期研究基础上，参考正交试验设计优选出的最佳提取工艺[8]，最终选定80%乙醇，回流提取3次，每次1 h，料液比1∶10提取。

MimengosideⅠ附近的峰分离有一定难度，本实验考察了甲醇水系统80∶20，85∶15，82∶18，84∶16等多种流动相的比例，最终选定甲醇水82∶18时分离度最好，峰形也较好，并能使检测组分在20 min内实现较好的分离。根据流动相比例，分别在100，106，110 ℃的漂移管温度下，考察载气流速，最终确定ELSD检测器最优参数：漂移管温度106 ℃，N2流速15 L·min-1。

本文选取从醉鱼草果实中分得的3种齐墩果烷型三萜皂苷类化合物clinoposaponin Ⅲ，desrhamnoverbascosaponin，mimengosideⅠ作为指标性成分，其中mimengosideⅠ为课题组首次报道的新化合物[3]，采用HPLCELSD测定其中三萜类成分，相比于课题组前期建立的紫外分光光度法[5]，准确度更高、专属性更强。HPLCELSD测得结果，在一定程度上能反应醉鱼草果实中三萜类成分的总含量，方法学试验证明实验结果稳定可靠，表明该方法可行性较高。不同产地的醉鱼草果实中三萜成分的含量存在差异，这可能与产区生态环境、药材采收时间等因素有关，后续可开展有关醉鱼草不同采收期化学成分研究的实验工作。

[参考文献]

[1]江苏新医学院 中药大辞典下册[M] 上海： 上海科学技术出版社，1986： 1128

[2]吴德玲， 汪洋奎， 王训翠， 等 醉鱼草果实三萜类成分及其活性研究[J] 中药材， 2011， 34（12）：1884

[3]Wu D L， Wang Y K， Liu J S， et al Two new compounds from the fruits of Buddleja lindleyana with neuroprotective effect[J] J Asian Nat Prod Res， 2012， 14（4）： 342

[4]吴德玲， 汪洋奎， 刘劲松 醉鱼草果实的化学成分研究：Ⅱ[J]中成药， 2011， 33（12）： 2107

[5]任亚硕， 吴德玲， 张伟， 等 紫外分光光度法测定醉鱼草果实中总三萜含量[J] 安徽中医学院学报， 2012， 31（5）： 78

[6]沙东旭， 刘兆妍， 张满来， 等 HPLCELSD测定知母中知母皂苷BII的含量[J]药物分析， 2009， 29（12）： 2106

[7]张正光， 朱玲英， 钱士辉 HPLCELSD法测定细柱五加果实中两个齐墩果烷型三萜皂苷的含量[J]中国实验方剂学杂志， 2012， 18（18）： 82

[8]沈炳香， 吴德玲， 任亚硕， 等 正交设计优选醉鱼草果实总三萜提取工艺[J] 安徽医药， 2013， 17（2）： 186

[责任编辑吕冬梅]