重组人促红细胞生成素在脑白质损伤新生鼠经细胞外信号调节激酶信号通路对血管内皮生长因子受体2的影响

袁奇超，蒋　犁，朱丽华，虞大凡

东南大学医学院　附属中大医院儿科，南京 210009



·论著·

重组人促红细胞生成素在脑白质损伤新生鼠经细胞外信号调节激酶信号通路对血管内皮生长因子受体2的影响

袁奇超，蒋犁，朱丽华，虞大凡

东南大学医学院附属中大医院儿科，南京 210009

摘要：目的探讨重组人促红细胞生成素在脑室周围白质损伤中颅内经细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路对血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的影响。方法选取出生后4日龄SD大鼠，采用随机数余数分组法分为假手术组、缺氧缺血组和药物干预组。缺氧缺血和药物干预组幼鼠结扎右侧颈总动脉并吸入6%的氮氧混合气体2 h，假手术组幼鼠仅游离右侧颈总动脉。药物干预组脑室内给予重组人促红细胞生成素1次(0.6 IU/g体质量)，假手术组和缺氧缺血组给予等量的生理盐水。用Western blot方法检测术后60、90 min脑组织中的ERK和磷酸化-ERK及术后2、4 d脑组织中的VEGFR2表达情况。结果术后60及90 min，缺氧缺血组磷酸化-ERK较假手术组显著增多(P<0.05)，促红细胞生成素干预后磷酸化-ERK表达进一步上调(P<0.05)。术后2 d，缺氧缺血组和假手术组大鼠的VEGFR2表达差异无统计学意义，术后4 d缺氧缺血组VEGFR2表达增加(P<0.05)，药物干预组VEGFR2的表达较缺氧缺血组显著增加(P<0.05)。结论促红细胞生成素可能通过影响颅内ERK信号通路调节VEGFR2的表达。

关键词：促红细胞生成素；脑室周围白质损伤；细胞外信号调节激酶；血管内皮生长因子受体2

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：217-221

脑室周围白质损伤(periventricular white matter damage，PWMD)是早产儿脑损伤最常见、最严重的类型，是一种由于感染、缺氧/缺血等因素引起的以脑白质损伤为主的脑损伤形式[1]。关于PWMD的治疗，目前尚无特效疗法，避免导致PWMD发生的各种危险因素是关键，一旦发现PWMD患儿应尽早干预，以提高其生活质量。根据早产儿脑白质损伤发生的原因及其机制，目前可能的干预措施包括产前应用硫酸镁、糖皮质激素、抗生素、褪黑素、别嘌呤醇、N-乙酰半胱氨酸、一氧化氮合酶抑制剂、维生素E等，产后应用促红细胞生成素及其衍生物、低温治疗、惰性气体、褪黑素、别嘌呤醇、神经营养因子、吸入一氧化氮、维生素E、托吡脂、消炎痛、细胞因子拮抗剂、细胞移植等。有研究表明重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rh-EPO)给早产儿脑白质损伤的干预及治疗带来了一线曙光[2- 3]。然而，对其具体通路机制的研究国内外少有报道。本研究建立新生大鼠PWMD模型，初步探讨rh-EPO对细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK) 信号通路的影响。

材料和方法

实验动物及分组清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，购自南京军区医学动物实验中心[许可证号SLXK(军)]，东南大学动物实验中心饲养，饲养条件为22℃±2℃，昼夜周期12 h/12 h。大鼠合笼分娩后取新生4日龄SD幼鼠120只，雌雄不限，体质量11.0～13.2 g。采用随机数余数分组法随机分为假手术组、缺氧缺血组(结扎右侧颈总动脉后通低浓度的氧气)和药物干预组(注射促红细胞生成素)，每组40只。

PWMD动物模型制备及给药参照文献[4]建立的PWMD动物模型制作方法，异氟烷吸入麻醉1～2 min后固定于仰卧位，颈部正中切口，缺血缺氧组及药物干预组分离并永久性结扎右侧颈总动脉，术毕缝合切口，术中出现大量出血的幼鼠被剔除。术后放回母鼠笼中恢复2～3 h，然后送入37℃恒温箱中并通入混合气体(6% O2、94% N2)2 L/min持续2 h。假手术组幼鼠仅游离右侧颈总动脉，未予结扎和缺氧。药物干预组术后固定于脑立体定位仪上，头皮消毒，作一切口暴露前囟点，立体定位于右侧脑室(坐标：前囟点后1.0 mm，侧1.0 mm，深2.5 mm)，经幼鼠脑定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，货号68507)将0.6 IU/g体质量rh-EPO(益比奥，规格：3 000 IU/ml，批号：国药准字S19980074，厂家：沈阳三生制药有限责任公司)经微量注射器缓慢注入脑内持续5 min，然后留针2 min再缓慢拔出，假手术组和缺氧缺血组经相同的方法脑立体定位后给予相同体积的生理盐水。

Western blot检测总ERK及磷酸化的ERK分别于术后60、90 min，每组各取8只，异氟烷吸入麻醉后断头取脑，游离出幼鼠右侧大脑半球，检测总ERK及磷酸化的ERK(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase，P-ERK)；分别于术后2、4 d，每组各取8只，游离出幼鼠右侧大脑半球，检测血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)。各脑组织取50 mg，与加样缓冲液4∶1体积混合，煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再转至聚偏二氟乙烯膜后放入5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗兔抗大鼠ERK抗体(1∶1 000，抗-ERK1+ERK2 抗体，ab115799，abcam)或抗P-ERK(磷酸化Y204)抗体(1∶500，抗-ERK1抗体，ab131438，abcam)或抗VEGFR2(1∶1 000，抗-VEGFR2抗体，ab10972，abcam)抗体，4℃孵育过夜，加入二抗(1∶5 000羊抗兔 IgG H&L，ab6721，abcam或1∶5 000，羊抗鼠 IgG H&L，ab6789，abcam)室温孵育1.5 h，化学发光法显影及定影，以GAPDH作为内参。结果用Image-J软件J(version 1.38)进行灰度分析，采用目的蛋白条带与内参照GAPDH条带灰度值的比值作为结果，以此表示目的蛋白的表达水平。

结果

一般情况120只SD大鼠造模过程中及术后共死亡24只，死亡率20.0%；其中缺血缺氧组死亡12只，死亡率27.3%；药物干预组死亡9只，死亡率21.9%；对照组死亡3只，死亡率8.5%。术后缺血缺氧组和药物干预组大鼠未见明显发绀，有活动减少、喂养困难、体质量增长缓慢表现，且缺血缺氧组表现相对明显；对照组体质量增长正常。对照组大鼠双侧脑室大小相似，染色均一，细胞排列整齐，形态大小均正常。缺血缺氧组大鼠右侧脑室较对侧明显增大，脑室形状不规则，白质区着色较浅，细胞排列疏松、层次混乱，可见水肿，细胞周围间隙增宽，部分神经细胞变性、坏死。而且，缺氧缺血组大鼠有远期运动发育、学习和记忆障碍。

总ERK及磷酸化ERK表达变化ERK蛋白检测结果显示，3组术后60 min(F=2.45，P=0.21)和90 min(F=1.98，P=0.33)总ERK差异均无统计学意义。磷酸化ERK蛋白检测结果显示，缺氧缺血组大鼠术后60、90 min磷酸化ERK蛋白较假手术组显著增加，经rh-EPO治疗后，磷酸化ERK蛋白明显高于缺氧缺血组(P均<0.05)(图1)。

VEGFR2表达变化术后2 d，缺氧缺血组大鼠VEGFR2 表达与假手术组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，经rh-EPO治疗后，VEGFR2进一步增加，且与假手术组及缺氧缺血组差异有统计学意义(P<0.05)。术后4 d，缺氧缺血组大鼠VEGFR2表达较假手术组显著增加，且经rh-EPO干预后，VEGFR2进一步增加(P均<0.05)(图2)。

讨论

早产儿是神经系统受损的高危人群，其脑瘫发病率并未随着存活率增高而降低。目前早产儿脑损伤治疗方法仍处于临床研究阶段，及时EPO治疗是目前研究较多的热点，大部分研究得到肯定作用，但其中的机制仍在研究中。了解EPO对新生儿神经保护作用的相关机制并将其与临床研究相结合，是临床治疗的前提和基础。有研究显示，在鼠PWMD模型中，rh-EPO促进了脑白质区的血管新生反应[5]。而本研究显示这种血管新生反应可能通过影响颅内分裂原活化抑制剂/细胞外信号调节激酶信号通路进行调节。

ERK：细胞外信号调节激酶；P-ERK：磷酸化细胞外信号调节激酶；GAPDH：甘油醛- 3-磷酸脱氢酶；HI：缺血缺氧；EPO：促红细胞生成素；Mr:相对分子质量；与假手术组比较，aP<0.05；与HI组比较，bP<0.05ERK：extracellular signal-regulated kinase；P-ERK：phosphorylation extracellular signal-regulated kinase；GAPDH：glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase；HI：hypoxia-ischemia；EPO：erythropoietin；Mr:relative molecular mass;aP<0.05 compared with the sham group；bP<0.05 compared with the HI group

图 1ERK及磷酸化-ERK Western blot条带图(A)及柱状图(B)

Fig 1Representative bands (A) and bar graph (B) showing ERK and phosphorylation-ERK expression

VEGFR2：血管内皮生长因子受体2；与假手术组比较，aP<0.05;与HI组比较，bP<0.05

VEGFR2：vascular endothelial growth factor receptor 2；aP<0.05 compared with the sham group；bP<0.05 compared with the HI group

图 2VEGFR2 Western blot条带图(A)及柱状图(B)

Fig 2Representative bands (A) and bar graph (B) showing VEGFR2 expression

VEGFR2(也被称作KDR或Flk- 1) 是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的高亲和性受体，在血管再生和血管新生中都是最重要的分子，几乎和所有细胞中的VEGF均有作用，对血管内皮细胞增殖、肿瘤的生长和转移都发挥重要作用[6]。VEGFR2不仅表达在血管和淋巴管的内皮细胞中促进内皮细胞的聚集，而且在正常的干细胞中也有表达[7]。有研究显示EPO干预PWMD后脑白质中的VEGF表达上调[8]。本研究显示EPO治疗组的幼鼠脑白质中的VEGFR2的表达较缺氧缺血组增加。而且在肿瘤血管的研究中已经发现VEGFR2的表达量和肿瘤血管的新生和肿瘤发生密切相关[9]。参与调控血管生成的两个重要因子(受体与配体)都有明显上调，当VEGF与VEGFR2结合前后就会引发上下游通路中无数中间信号形成级联反应，最终以内皮细胞增殖、存活、迁移、通透性增加及浸润到周围组织等不同形式改变血管功能。

ERK信号通路是由一个小的三磷酸鸟苷结合蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶级联反应。一般认为ERK是生存通路，其在神经元的增殖分化以及抑制神经元凋亡中发挥重要作用[10- 11]。但是在肿瘤血管生成的研究中显示ERK信号通路参与肿瘤血管内皮细胞的水平、垂直和定向迁移[12]。本研究显示，脑组织中有ERK和P-ERK的表达，缺氧缺血后ERK表达未见变化，但P-ERK增加，提示缺氧可能是激活ERK通路的一种因素。另有研究显示大鼠脑缺血预处理后，ERK1/2磷酸化持续存在至少3 d后才回到正常水平[13]。EPO治疗的大鼠脑组织中ERK表达较缺氧缺血组无变化，但P-ERK的表达情况则明显增高，EPO促进了ERK的磷酸化，提示EPO对ERK信号通路产生了影响。ERK通路的激活促进细胞持续增殖或存活，如果细胞持续增殖而不迁移就会产生内皮细胞堆积的血管结构，形成囊腔。本研究显示EPO治疗的大鼠脑组织中的VEGFR2增加，所以ERK信号通路很可能参与了PWMD后的血管新生。关于血管生成的研究，在血管瘤中还发现磷酸酰肌醇- 3激酶/蛋白激酶B信号通路也参与了血管生成的调节[14]，对于ERK信号通路的研究还显示分裂原活化抑制剂/细胞外信号调节激酶信号通路在EPO促进肠道叶酸吸收中发挥调控作用[15]。其实EPO为神经细胞的发育和存活提供了有力条件，在体内外实验研究中已证实EPO可通过一系列广泛的细胞信号传导通路发挥神经保护作用，其中抗神经细胞凋亡是目前研究最深入的机制之一，且在新生鼠模型[16]以及体外实验[17]中均有发现，除了EPO促进血管新生外，其他机制包括抗炎、营养神经、抗氧化及抗惊厥等作用。

综上，本研究初步探讨了EPO促血管新生反应可能通过激活ERK信号通路，但是血管新生是一个极其复杂的过程，要了解其详细的机制尚需进一步深入的研究。

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Impacts of Erythropoietin on Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 by the Extracellular Signal-regulated Kinase Signaling Pathway in a Neonatal Rat Model of Periventricular White Matter Damage

YUAN Qi-chao，JIANG Li，ZHU Li-hua，YU Da-fan

Department of Pediatrics，Zhongda Hospital,Medicine School，Southeast University，Nanjing 210009，China Corresponding author：JIANG LiTel：025- 83262767，E-mail：jiangli77777@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the impacts of erythropoietin on vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) by the extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway in a neonatal rat model of periventricular white matter damage. MethodsAll of postnatal day 4 rats were randomized into three groups：the sham group [without hypoxia-ischemia (HI)]，the HI group (HI with saline administration)，and the erythropoietin(EPO) group [HI with recombinant human erythropoietin(rh-EPO) administration]. Rat pups underwent permanent ligation of the right common carotid artery，followed by 6% O2 for 2 hours or sham operation and normoxic exposure. Immediately after the HI，rats received a single intraventricular injection of rh-EPO (0.6 IU/g body mass) or saline. ERK and phosphorylation-ERK were examined at 60 minutes and 90 minutes after operation，and VEGFR2 were detected at 2 and 4 days after operation by using Western blot. ResultsAt 60 minutes and 90 minutes after operation，the proteins of phosphorylation-ERK were significantly higher in HI rats than in the sham rats and significantly higher in HI+EPO rats than in the HI rats (P<0.05). Two days after operation，VEGFR2 was not significantly different between sham and HI rats. However，the proteins of VEGFR2 were increased after administration of rh-EPO(P<0.05). Four days after operation，the proteins of VEGFR2 were significantly higher in HI rats than in the sham rats and significantly higher in HI+EPO rats than in the HI rats(P<0.05).ConclusionEPO may regulate VEGFR2 expression by affecting the intracranial ERK signaling pathways.

Key words：erythropoietin；periventricular white matter damage；extracellular signal-regulated kinase；vascular endothelial growth factor receptor 2

(收稿日期：2015- 10- 10)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.016

中图分类号:R722.1

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)02- 0217- 05

通信作者：蒋犁电话：025- 83262767，电子邮件：jiangli77777@126.com