基于解淀粉芽胞杆菌的发酵谷朊粉制备工艺

钟晨滑，贠婷婷，綦文涛，李爱科，金征宇

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122) 2(国家粮食局科学研究院，北京，100037)



基于解淀粉芽胞杆菌的发酵谷朊粉制备工艺

钟晨滑1,2，贠婷婷2，綦文涛2，李爱科2，金征宇1*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122) 2(国家粮食局科学研究院，北京，100037)

摘要为了开发基于发酵法基础上的新型谷朊粉深加工产品，选取解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株，以发酵后底物中的有效谷氨酰胺含量为评价指标，通过单因素和正交试验优化了发酵谷朊粉的工艺条件：m(种子液)∶m(谷朊粉)∶m(水)=2∶5∶8，发酵时间16 h，发酵温度为40 ℃。在此条件下，发酵谷朊粉获得的肽中有效谷氨酰胺含量为204.62 mg/g。通过与酶解谷朊粉产品进行对比发现，发酵谷朊粉具有更高的有效谷氨酰胺(gln)、水溶性蛋白和小分子肽含量(P<0.05)。

关键词解淀粉芽胞杆菌；发酵谷朊粉；工艺优化；酶解谷朊粉

谷朊粉俗称活性面筋，是小麦粉经水洗去淀粉和其他水可溶性物质后剩下的面筋粉体[1]。谷朊粉中蛋白质含量在75%以上，氨基酸种类齐全，是营养丰富，物美价廉的植物蛋白源[2]。然而，由于谷朊粉含有较多疏水性氨基酸，分子内疏水作用区域大，导致其溶解度低，人体吸收困难[3]，不能满足食品加工的需要[4]，从而限制了谷朊粉的应用。

近年来，研究者尝试采用多种蛋白酶水解方法，打开谷朊粉网络结构，扩大谷朊粉的应用领域[5]。然而，目前酶解谷朊粉仍然存在问题，具体有：商品化酶的价格昂贵，使得酶解成本居高不下[6]；通过酶解法制备的小肽口感不佳[7]；酶解所用酶的种类单一，只在特定的氨基酸片段上切断肽链，降解程度有限。

蛋白质降解除了酶解法外，还常常用到发酵法。相对于酶解法，发酵法酶系丰富，酶切位点多[8]，蛋白水解度更大，可产生更多的小分子蛋白及肽类物质。然而目前，基于发酵法基础上的谷朊粉深加工研究还不多见。本研究以解淀粉芽胞杆菌为发酵菌株，以有效谷氨酰胺的含量为主要指标，对发酵谷朊粉的工艺参数进行优化；并以市售酶解谷朊粉产品为对照，对发酵谷朊粉的基本品质进行了对比分析，以期为基于发酵法基础上的谷朊粉深加工提供参考。

1材料与方法

1.1实验材料与仪器

本研究以蛋白酶活性为筛选标准，选取本实验室保存的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为发酵菌株[9-10]，菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC 10382。

谷朊粉，中鹤集团提供； AAS-18氨基酸标准品，sigma公司； Alcalase 2.4L，诺维信公司。

试剂：1,1-三氟乙酸基碘苯(BTI)，乙腈，吡啶，浓盐酸(优级)，柠檬酸三钠(优级)，柠檬酸(优级)，茚三酮，其他试剂均为国产分析级试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

仪器：超净工作台，Thermo公司；凯氏定氮仪，FOSS公司；氨基酸分析仪，HITACHI公司；高效液相色谱，waters公司。

1.2实验方法

1.2.1发酵工艺流程

用牛肉膏蛋白胨培养基活化解淀粉芽孢杆菌，扩大培养制成种子液，种子液的活菌数要求为1.0×109CFU/mL。将种子液、谷朊粉、水按比例混合均匀，进行发酵。将所得发酵液在55 ℃条件下烘干，得到发酵后样品。其发酵工艺流程如图1所示。

图1　谷朊粉发酵工艺流程图Fig.1　Gluten fermentation process

1.2.2蛋白质含量测定

使用Foss 5800 Kjeltec凯式定氮仪，根据GB/T 14489.2—2008，测定样品蛋白质含量和水溶性蛋白含量。

1.2.3水溶性肽分子量分布

采用高效液相凝胶过滤色谱法。具体操作为：取1.00 g发酵后样品，加入20 mL超纯水，将其放入25 ℃空气浴摇床，振荡2 h，将混合液于4 000 r/min离心20 min后取上清液过0.45 μm微孔滤膜，上机测定。标准品分别为：细胞色素 C(MW12 384)、还原型谷胱甘肽(MW307.3)、抑肽酶(MW6 511.4)和杆菌肽(MW1 422.69)。

其中色谱条件为：色谱柱，TSK gel G2000 SWXL 7.8 mm×300 mm；检测器， 2487紫外检测器；波长：220 mm；柱温：30 ℃；流动相：水/三氟乙酸=1 000/1；流速：1 mL/min；上样量：20 μL。

1.2.4有效谷氨酰胺含量测定

底物中有效谷氨酰胺的含量测定参考马洪龙[11]等的方法，具体过程如下：

谷氨酰胺的BTI保护反应：准确称取1 g发酵后样品，用纯净水稀释200倍。将其放入25 ℃空气浴摇床，振荡2 h，将混合液于4 000 r/min离心20 min后，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，制得蛋白水溶液。取100 μL蛋白水溶液于微量反应瓶中，加入100 μL BTI-乙腈溶液(10 mg/mL)和50 μL吡啶水溶液(50 mmol/L)，混匀后充氮，50 ℃反应4 h，氮气吹干后作为BTI制备样。另取100 uL蛋白溶液于微量反应瓶中，氮气吹干后作为对照样。

BTI制备样和对照样中各加入200 μL 6 mol/L的优级HCl，110 ℃水解24 h，氮气吹干后，加入200 μL纯净水溶解，再次氮气吹干，并反复溶解吹干3次。最后两组样品各加入1.5 mL 0.02 mol/L HCl溶液，过0.45 μm水系膜于进样瓶中，采用日立L-8800氨基酸自动分析仪进行分析。

标准品的配制：取AAS-18氨基酸标准品(Sigma)1 mL，用0.02 moL/L的HCl溶液稀释至25 mL，移取此稀释液1.5 mL，过0.45 μm微孔滤膜，滤液入样品瓶中上机待测，上样量20 μL。计算公式：

gln含量(mg/g)=

(1)

式中：υ0，20 μL对照样中有效gln总量，ng；υ1，20 μL BTI保护样中有效gln总量，ng。

1.3数据处理

数据处理采用 origin8.5和SPSS17.0统计分析软件进行处理，各组间均数差异性比较采用的是One-Way ANOVA方法。各组数据结果均以mean±sd表示，检验水准设为0.05，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果与讨论

2.1发酵工艺参数的单因素分析

2.1.1料水比对有效gln含量的影响

保持其他条件不变[m(种子液)∶m(谷朊粉)=1∶5，发酵温度37 ℃，发酵时间8 h]，分别研究谷朊粉与水的质量比为5∶4，5∶6和5∶8时，发酵底物中有效谷氨酰胺的含量，结果如图2所示。

图2　不同料水比对发酵谷朊粉底物中有效谷氨酰胺含量的影响Fig.2　Effect of gluten/water ratio on effective glutamine content in substrate of fermented wheat gluten

随着谷朊粉/水的增加，发酵底物中有效谷氨酰胺含量降低，当谷朊粉与水的质量比为5∶4时，发酵底物中有效谷氨酰胺含量可达126.62 mg/g。但当谷朊粉与水的质量比为5∶4时，由于黏度过大，致使混合物流动性差，无法进行搅拌，且高黏度导致传质效果差，菌体很难得到所需养分，造成增殖困难。因此，高比例的料水比并不适用于谷朊粉发酵。

2.1.2发酵时间的确定

保持其他条件不变[m(种子液)∶m(谷朊粉)∶m(水)为1∶5∶6，发酵温度37 ℃]，分别研究发酵0、4、6、8、10、12、16、20 h时，底物中有效谷氨酰胺含量，结果如图3所示。在0～12 h之间，随着发酵时间的延长，底物中有效谷氨酰胺含量明显上升(P<0.05)，发酵12 h时显著高于10 h时，发酵16 h时可达199.31 mg/g。当发酵时间高于16 h时，有效谷氨酰胺含量不再上升，甚至有下降的趋势。这是由于在发酵初期，微生物处于对数生长期，生长和代谢旺盛、酶活力强，因此，其酶解产物生成迅速。随着时间的延长，微生物进入稳定期，其代谢活性达到顶峰，谷氨酰胺含量不再增加，甚至随着时间的延长，谷氨酰胺存在被微生物本身消耗的可能，导致其生成量降低。

图3 发酵时间对发酵谷朊粉底物中有效谷氨酰胺含量的影响Fig.3　Effect of fermentation time on effective glutamine content in substrate of fermented wheat gluten

2.1.3发酵接种量的确定

保持其他条件不变[m(谷朊粉)∶m(水)为5∶6，发酵温度37 ℃，发酵时间8 h]，分别研究种子液与谷朊粉的质量比分别为1∶25、1∶5、2∶5、3∶5和4∶5时，有效谷氨酰胺的生成情况，结果如图4所示。

图4　初始接种量对发酵谷朊粉底物中有效谷氨酰胺含量的影响Fig.4　Effect of strain/gluten raito on effective glutamine content in substrate of fermented wheat gluten

随着种子液的增加，有效谷氨酰胺含量呈先上升后下降的趋势。这是由于，随着种子液的增加，起始发酵液中的微生物活菌数随之增加，代谢活性高，酶含量上升迅速，蛋白降解及有效谷氨酰胺生成能力强。而随着接种量继续增大，代谢产物增加迅速，由于微生物产物抑制效应，菌体的活性反而降低，另一方面由于菌体数目过多，相互竞争加大，对营养物质的竞争导致菌体生长活性降低[12]。图4中，种子液与谷朊粉的质量比为2∶5时，有效谷氨酰胺含量较1∶5比例的有效谷氨酰胺含量显著增加(P<0.05)；种子液与谷朊粉的质量比为4∶5的有效谷氨酰胺含量较2∶5接种量的有效谷氨酰胺含量显著降低(P<0.05)。

2.1.4发酵温度的确定

保持其他条件不变[m(种子液)∶m(谷朊粉)∶m(水)为1∶5∶6，发酵时间8 h]，分别研究28、33、37和40 ℃时，发酵底物中有效谷氨酰胺的含量变化，结果如图5所示。37 ℃时，谷氨酰胺含量显著高于其他温度下含量(P<0.05)，可达119.60 mg/g，表明本研究所采用的解淀粉芽孢杆菌在37 ℃时具有较高的增殖和代谢活性。

图5　温度对发酵谷朊粉底物中有效谷氨酰胺含量的影响Fig.5　Effect of temperature on effective glutamine content in substrate of fermented wheat gluten

2.2发酵工艺参数的正交实验优化

根据上述单因素试验结果，以发酵时间、种子液/谷朊粉、谷朊粉/水和发酵温度为因素，选取发酵后底物中有效谷氨酰胺含量作为评价指标，采用L9(34)正交设计对工艺条件进行优化。因素水平详见表1，结果详见表2和表3。

表1　正交试验因素水平表

m(种子液)∶m(谷朊粉)∶m(水)为3∶5∶8，发酵时间12 h，发酵温度40 ℃时，发酵谷朊粉产物中有效谷氨酰胺含量可达200.25 mg/g。由极值分析得出影响发酵谷朊粉产物中有效谷氨酰胺含量的因素主次顺序为∶接种量>水含量>发酵温度>发酵时间，按各因素水平应选择组合A2B3C2D3作为最佳发酵组合，即m(种子液)∶m(谷朊粉)∶m(水)为2∶5∶8，发酵时间为16 h，发酵温度为40 ℃。

表2　正交试验结果

表3　各因素方差分析

2.3发酵最佳工艺参数优化与产品评价

为了进一部验证正交试验结果，本研究重复了最佳工艺条件下的发酵情况，并以本实验室酶解谷朊粉产品[11]作为对照，对产品中有效谷氨酰胺含量进行对比分析。其中酶解条件为：碱性蛋白酶Alcalase 2.4L， pH 8.0，温度60 ℃，酶浓度4%，底物浓度7%，反应时间100 min，结果如图6所示。

图6　不同处理有效Gln含量Fig.6　Effective glutamine content in different processing of wheat gluten

最佳工艺条件下重复实验中有效谷氨酰胺肽含量可达204.62 mg/g，与正交实验结果一致。发酵和酶解谷朊粉中有效谷氨酰胺含量显著高于未处理过的谷朊粉(P<0.001)，且发酵谷朊粉显著高于酶解谷朊粉(P<0.05)，比后者高出23.05%。

本研究以未处理谷朊粉为对照，对发酵和酶解条件下谷朊粉中蛋白和小肽等的含量进行了对比分析，结果如表4和表5所示。发酵谷朊粉粗蛋白含量分别比未发酵和酶解条件下高2%和0.66%。而水溶性蛋白方面，发酵谷朊粉的优势进一步突出，可达未发酵谷朊粉的19.7倍，高出酶解谷朊粉30.5%。小分子多肽方面，分子质量为5 000～10 000 Da的大分子肽含量上，相对于谷朊粉，发酵和酶解谷朊粉均表现出了明显的优势，且发酵效果更佳，比酶解高出8.67%；分子质量为1 000～5 000 Da的多肽，未发酵条件下的谷朊粉中未检测出，而发酵和酶解含量分别为45.8 mg/g和27.61 mg/g，且前者高出后者65.89%；分子质量<1 000 Da的小肽，发酵谷朊粉优势更加明显，比未发酵条件下增长46.17倍，比酶解条件下高出57.72%。

表4　不同处理谷朊粉中蛋白的含量

表5　不同处理谷朊粉中肽分布和含量

注：其中蛋白系数按5.7[13]计算

对于蛋白和小肽等功能活性物质来讲，通常是水溶性越好，越容易被人体或动物吸收，从而发挥其特有功效，这也是近几年来小肽越来越多被发现具有多种健康功效的原因[14-15]。上述结果表明，发酵过程带来的高含量水溶性蛋白和小分子肽，对于谷朊粉的营养价值和健康功效更具有显著的提升作用。

3结论

本文采用微生物发酵法对谷朊粉进行了深加工研究。通过单因素和正交实验确定解淀粉芽孢杆菌发酵谷朊粉的最佳工艺为：m(种子液)∶m(谷朊粉)∶m(水)=2∶5∶8，发酵时间16 h，发酵温度为40 ℃。在此条件下，发酵谷朊粉中有效谷氨酰胺的含量可达204.62 mg/g，比酶解谷朊粉中有效谷氨酰胺含量高23.05%。此外，发酵谷朊粉的水溶性蛋白比酶解谷朊粉高出30.5%，不同分子量的小肽含量均有较大程度提高。本研究结果表明，相对于酶解谷朊粉，发酵谷朊粉含有更多的有效谷氨酰胺和蛋白类功能活性成分，因此具有更高的营养价值和应用潜力。

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Optimization of wheat gluten fermentation based onBacillusamyloliquefaciens

ZHONG Chen-hua1,2, YUN Ting-ting2, QI Wen-tao2, LI Ai-ke2, JIN Zheng-yu1*

1(The School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxin 214122,China) 2(Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

ABSTRACTIn order to develop a new gluten processing product based on the fermentation method, a strain of Bcillus amyloliquefaciens was used to perform the fermentation, and the concentration of effective glutamine in the substrate was evaluated as a main index. In this study, the optimum conditions of the fermentation by single factor and orthogonal test were obtained as follows: inoculum/gluten/water=2∶5∶8, fermentation time 16 h, and fermentation temperature 40 ℃. Under this condition, we got a maximum effective glutamine content of 204.62 mg/g. Compared with commercially available enzymatic hydrolysis wheat gluten, the fermentation product had higher contents of effective glutamine, water-soluble protein, and small molecule peptide(P<0.05). Therefore, the fermentation of wheat gluten has better health benefits and potential applications, and can provide a new way for gluten processing.

Key wordsBacillus amyloliquefaciens;wheat gluten fermentation;process optimization;enzymatic hydrolysis of wheat gluten

收稿日期：2015-10-09，改回日期：2015-12-18

基金项目：十二五支撑项目“新型优质蛋白饲料原料生产关键技术研究”(2011 BAD26B01-3)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604003

第一作者：硕士研究生(金征宇教授为通讯作者，E-mail:zjin@jiangnan.edu.cn)。