低胰蛋白酶抑制剂活力的白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法探究

让一峰，赵伟，杨瑞金

1(江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)



低胰蛋白酶抑制剂活力的白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法探究

让一峰1，赵伟2*，杨瑞金2

1(江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)2(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

摘要研究了酸碱处理、热处理、超高压、酸沉和超滤对白芸豆中α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor，α-AI)和胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI)活力的影响，旨在为工业化制备低TI活力的白芸豆α-AI提供指导。α-AI和TI在25 ℃时具有良好的酸碱稳定性(pH 3.00～10.00)。60 ℃时的酸处理对TI活力无显著影响(P>0.05)，而α-AI活力则会显著降低(P<0.05)，碱处理对α-AI活力造成的损失大于对TI活力造成的损失。超高压(200～500 MPa)处理不影响α-AI活力，200 MPa的压力对TI无显著影响(P>0.05)，高于200 MPa的压力显著增强TI活力(P<0.05)。在酸沉(pH 5.2、4.4和3.6)中，α-AI基本不沉降, TI的沉降率不超过23.77%。截留分子质量为30 000 u的Millipore超滤系统和膜分离中试装置对白芸豆水提液中α-AI的截留率分别为98.32%和84.63%，对TI 的截留率分别为27.20%和20.77%。因此，超滤有助于实现白芸豆α-AI和TI的工业化分离。

关键词α-淀粉酶抑制剂；胰蛋白酶抑制剂；超高压；超滤

α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor, α-AI)是一类能与α-淀粉酶结合并改变其构象，从而降低α-淀粉酶活力的含氮碳水化合物或大分子蛋白质，普遍存在于各种豆类和谷物之中[1]。其中白芸豆(White kidney bean)α-淀粉酶抑制剂是一种蛋白类抑制剂，能够专一性抑制人类唾液及肠道α-淀粉酶，延缓淀粉分解，降低餐后血糖，加之其较强的生理活性和较高的生物安全性，因而被广泛应用于商业抗肥胖和抗糖尿病等产品中，这些产品在国外被称为“淀粉阻断者(starch blocker)”[2]。随着人们生活水平的提高，肥胖症和糖尿病的形势日趋严峻[3]，白芸豆α-淀粉酶抑制剂的应用前景将更为广阔。

尽管白芸豆α-淀粉酶抑制剂在控制血糖、降低食欲和减轻体重等方面的作用已被大量动物实验和人体实验所证实，但许多“淀粉阻断者”并不能发挥其应有的生理作用,其主要原因是这些产品中存在着较多的胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor, TI)。胰蛋白酶抑制剂是白芸豆中存在的一种蛋白类抗营养因子，能够刺激胰脏产生过多的淀粉酶而导致α-淀粉酶抑制剂在体内的生理作用降低或消失[2]。离子交换色谱法和凝胶柱色谱法可以从白芸豆中制备得到不含有胰蛋白酶抑制剂的活力的高纯度α-淀粉酶抑制剂，但色谱法生产周期长，生产成本高，环境污染大，因而难以用于工业化生产，无法满足市场需求[4]。

本文研究了酸碱处理、热处理、超高压、酸沉以及超滤等工业化处理方法对白芸豆中α-淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂活力的影响，旨在阐明白芸豆中α-淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂在理化性质方面的一些差异，为实现工业化制备少含或不含胰蛋白酶抑制剂活力的白芸豆α-淀粉酶抑制剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与设备

白芸豆，购于云南丽江，真空包装，颗粒饱满，大小均一；猪胰α-淀粉酶(PPA)、胰蛋白酶、BApNA，美国Sigma-Aldrich；其他试剂均为分析纯。

高静水压处理系统，内蒙古包头科发高科技食品有限公司；Millipore超滤系统，美国Millipore公司；膜分离中试装置，无锡海思瑞科技有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；PK-820电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；MP-501A超级恒温循环槽，上海一恒科学仪器有限公司；冷冻离心机，美国Beckman公司；精密pH计, METTLER TOLEDO。高速冷冻离心机，美国Thermo Scientific公司；WK-1000A型高速药物粉碎机，青州市精诚机械有限公司。

1.2试验方法

1.2.1白芸豆水提液的制备

参照WANG[4]的方法。用高速中药粉碎机将白芸豆粉碎，收集过60目筛的豆粉。将豆粉与去离子水按1∶10(g∶mL)的比例于室温下搅拌提取2 h后，在8 000 r/min，4 ℃下离心30 min，将上清液过120目筛以去除漂浮颗粒后收集清液，即为白芸豆水提液。白芸豆水提液的pH为6.39±0.04，α-AI活力和TI活力分别为8.32±0.02 U/mL、822.98±10.03 U/mL。

1.2.2白芸豆水提液的酸碱处理及热处理

将白芸豆水提液用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH 分别调pH至3.00、4.00、5.00、6.39、8.00、9.00和10.00，在25和60 ℃下恒温搅拌处理30 min后，于冰浴中迅速冷却至室温(25 ℃)。用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH将pH调回至6.39，于5 000 r/min，4 ℃下离心15 min后收集上清液，测定其相对α-AI活力和相对TI活力。

1.2.3白芸豆水提液的超高压处理

将白芸豆水提液装入聚丙烯真空袋中，赶出气泡，真空热封包装后分别在室温下于200、300、400和500 MPa下保压10 min，以未经超高压处理的白芸豆水提液作为空白对照。将超高压处理后的水提液于5 000 r/min，4 ℃下离心15 min后收集上清液，测定其相对α-AI活力和相对TI活力。

1.2.4白芸豆水提液的酸沉

将白芸豆水提液用1 mol/L HCl分别调至pH 5.20、4.40和3.60后于室温下静置1 h，在8 000 r/min，4 ℃下离心15 min后，收集上清液，用1 mol/L NaOH调节pH至6.39后测定α-AI活力和TI活力在上清液中分配比例。

1.2.5白芸豆水提液的超滤

采用Millipore超滤系统将1 L白芸豆水提液按以下工艺条件超滤：板式纤维膜；截留分子质量为30 000 u；膜面积为88 cm2；入口压力为0.12～0.14 MPa；出口压力为0 MPa；操作温度为25～35 ℃。测定Millipore超滤系统对α-AI活力和TI活力的截留率。

采用膜分离中试装置将15 L白芸豆水提液按以下工艺条件超滤：卷式纤维膜；截留分子质量为30 000 u；膜面积为1.80 m2；入口压力为0.30 MPa；出口压力为0.25 MPa；操作温度为25～35 ℃。测定膜分离中试装置对α-AI活力和TI活力的截留率。

1.3测定方法

1.3.1α-AI活力测定

参照YANG[5]的方法测定α-AI活力。将0.25 mL α-淀粉酶液与0.25 mL白芸豆提取液加入到0.5 mL磷酸盐缓冲液(pH 6.90)中，于37 ℃下预热10 min后加入0.5 mL 10 g/L淀粉溶液，精确反应5 min后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴10 min后置冰水浴中迅速冷却，加入5 mL去离子水，在540 nm波长下测定吸光值。空白以磷酸盐缓冲液代替α-淀粉酶液，对照以磷酸盐缓冲液代替白芸豆提取液。1个α-AI活力(1 U)定义为：1 min内抑制1μmol葡萄糖生成所需α-AI的量。相对α-AI活力(%)定义为白芸豆提取液处理后与处理前α-AI活力的百分比。

1.3.2TI活力测定

采用10 mL体系的BApNA法测定TI活力[6]。将0.4 mL胰蛋白酶液与0.4 mL白芸豆提取液于37 ℃水浴15 min后，加入2.8 mL BApNA 溶液(用pH 8.2的Tris-HCl缓冲液配制)，精确反应15 min后加入1 mL 30%(v/v)冰醋酸终止反应，定容至10 mL，在410 nm 波长下测定吸光值。空白先加冰醋酸，后加BApNA，对照以Tris-HCl缓冲液代替白芸豆提取液。1个TI活力(1 U)定义为该10 mL测定体系中抑制0.01个吸光度的增加所需TI的量。相对TI活力(%)定义为白芸豆提取液处理后与处理前α-AI活力的百分比。

1.4数据分析方法

采用SPSS16.0对数据进行ANOVA单因素方差分析及Ducan’s多重检验(P<0.05)。实验样本数n=3，在同一组单因素分析中出现大小写字母时，不同的字母小写表示α-AI活力有显著性差异(P<0.05)，大写表示TI活力有显著性差异(P<0.05)。

2结果与讨论

2.1酸碱处理和热处理对α-AI和TI活力的影响

图1为25 ℃时不同pH处理30 min对白芸豆水提液中α-AI和TI活力的影响。在25 ℃时，pH 3.00～10.00处理对白芸豆水提液中TI活力无显著影响(P>0.05)，表明TI在常温下具有良好的酸碱稳定性。pH 4.00～9.00处理对α-AI活力无显著影响(P>0.05)，尽管α-AI在pH 3.00、9.00和10.00处理后活力会显著降低(P<0.05)，但其活力损失率不超过10%，表明α-AI在常温下也具有良好的酸碱稳定性，但差于TI。

图1　25 ℃时pH对α-AI和TIA的影响Fig.1　Effects of pH on the activities of α-AI and TI at 25 ℃

图2为60 ℃时不同pH处理30 min对白芸豆水提液中α-AI和TI活力的影响。在60 ℃时，酸处理对TI活力无显著影响(P>0.05)，而碱处理会显著降低TI活力(P<0.05)，随着碱性的增强，TI活力损失增大。在60 ℃处理时，pH 6.39的白芸豆水提液中α-AI活力基本无损失(1.94%)，酸碱处理中其α-AI活力显著下降(P<0.05)，随着酸性或碱性的增强，α-AI活力损失增大。相比于酸处理，碱处理对α-AI活力造成的损失更大。在60 ℃时，TI的酸碱稳定性高于α-AI。在相同pH下，TI的热稳定性高于α-AI。结合图1和图2可以看出，升高温度可以降低α-AI和TI的酸碱稳定性，但是在同样的处理条件下，α-AI活力损失不小于TI活力损失。

图2　60 ℃时pH对α-AI和TIA的影响Fig.2　Effects of pH on the activities of α-AI and TI at 60℃

2.2超高压对α-AI和TI活力的影响

图3为不同压力(200～500 MPa)对白芸豆水提液中α-AI和TI活力的影响。除了400 MPa压力处理后α-AI活力显著上升(P<0.05)外，其他压力处理对α-AI活力无显著影响(P>0.05)，而且400 MPa压力处理仅使α-AI活力增加了4.35%，因此可以认为低于500 MPa的压力不会影响白芸豆α-AI活力。白芸豆α-AI主要依靠疏水作用和氢键维持其高级结构[2]，而不高于600 MPa的压力会降低疏水作用而稳定氢键[7-8]，白芸豆α-AI在此压力下的稳定性可能是其分子内部疏水作用减弱和氢键增多相互平衡的结果。200 MPa压力不会对TI活力产生显著影响(P>0.05)，当压力高于200 MPa时TI活力显著上升(P<0.05)，300 MPa压力处理对TI活力的增强效果最大，TI活力增加12.64%。超高压可以促使巯基形成二硫键[9]，而白芸豆TI的二硫键是其与胰蛋白酶相互作用的重要部位[10]，这可能是超高压处理增强白芸豆TI活力的原因之一。

图3　不同压力对α-AI和TI活力的影响Fig.3　Effects of various pressures on the activities of α-AI and TI

2.3酸沉后α-AI和TIA活力在上清液中的分配

图4为白芸豆水提液在不同pH(5.20、4.40和3.60)下酸沉后α-AI和TI活力在上清液中的分配情况。

图4　酸沉pH对α-AI和TI活力在上清液中分配比例的影响Fig.4　Effects of pH on the rates of α-AI and TI activities distributed in supernatants during isoelectric precipitation

尽管白芸豆α-AI的等电点在4.0～5.2之间[1]，但白芸豆水提液酸沉后，不低于90%的α-AI活力分配在上清液中，并且酸沉pH对α-AI活力的分配无显著影响(P>0.05)，表明白芸豆α-AI在等电点附近几乎不会沉降。白芸豆α-AI的这一性质可能是因为其较高的碳水化合物含量(11.8%)使其具备了良好的亲水性[5]。随着酸沉pH的降低，TI活力在上清液中的分配比例显著减少(P<0.05)，表明酸沉能够使TI沉淀，但是在酸沉pH为3.6时，TI活力在上清液中的分配比例依然很大(71.62%)，因而酸沉不能有效地分离白芸豆α-AI和TI。

2.4超滤对α-AI和TIA活力的截留效果

由于白芸豆α-AI的分子质量为56 000 u，TI的分子质量为8 000 u[2,10]，因此尝试截留分子质量为30 000 u的超滤膜对白芸豆水提液进行超滤。Millipore超滤系统对α-AI和TI活力的截留率分别为98.32%和27.20%，说明截留分子质量为30 000 u的超滤膜对α-AI和TI的分离效果良好。Millipore超滤系统是一种小型的超滤装置，为了验证超滤在规模化分离白芸豆水提液中α-AI和TI的可行性，采用膜分离中试装置对白芸豆水提液进行超滤，其超滤膜的截留分子质量为30 000 u。该中试装置对α-AI和TI活力的截留率分别为84.63%和20.77%，表明膜分离中试装置对α-AI和TI的分离效果与Millipore接近。膜分离中试装置对α-AI和TI活力的截留率均显著低于Millipore超滤系统(P<0.05)，可能是因为膜分离中试装置的死体积较大。因此，截留分子量为30 000 u的超滤膜的超滤系统有助于实现白芸豆α-AI和TI的工业化分离。

图5　两种超滤系统对α-AI和TI活力的截留率Fig.5　Retention rates of α-AI and TI activities in two ultra-filtration systems

3结论

以白芸豆为原料制备得到含有α-AI和TI活力的水提液，研究了酸碱处理、热处理、超高压、酸沉和超滤对α-AI和TI活力的影响，得出以下结论：

(1)α-AI和TI在25 ℃时具有良好的酸碱稳定性(pH 3.00～10.00)。60 ℃时TI的酸碱稳定性高于α-AI。

(2)超高压(200～500 MPa)不影响α-AI活力。200 MPa的压力对TI活力无显著影响(P>0.05)，当压力高于200 MPa时，TI活力显著增强(P<0.05)。

(3)在酸沉(pH 5.20，4.40 和3.60)中，α-AI基本不沉降，TI的沉降率不超过23.77%。

(4)截留分子量为30 000 u的Millipore超滤系统和膜分离中试装置对白芸豆水提液中α-AI的截留率分别为98.32%和84.63%，对TI 的截留率分别为27.20%和20.77%。两种超滤系统对α-AI和TI的分离效果良好，表明超滤有助于实现白芸豆α-AI和TI的工业化分离。

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Industrial preparation of white kidney bean α-amylase inhibitor with low trypsin inhibitor activity

RANG Yi-feng1, ZHAO Wei2*, YANG Rui-jin2

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Wuxi 214122, China) 2(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTEffects of acid and alkali treatment, heat treatment, ultra high pressure, isoelectric precipitation and ultra-filtration on the activities of α-amylase inhibitor (α-AI) and trypsin inhibitor (TI) from white kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) were investigated to provide directions for the industrial preparation of white kidney bean α-AI with low TI activities. At 25 ℃, both α-AI and TI owned a good pH stability (pH 3.00～10.00). At 60 ℃, acid treatment didn’t significantly affect TI activity(P>0.05)while significantly reduced α-AI activity (P<0.05). The activity losses of α-AI caused by alkali treatment were much larger than those of TI. α-AI activity wasn’t affected by ultra high pressure (200～500 MPa). Pressure at 200 MPa had no significant impact on TI activity (P>0.05)while the activity of TI was significantly enhanced at pressure above 200 MPa (P<0.05). During isoelectric precipitation (pH 5.2, 4.4 and 3.6), little α-AI and less than 23.77% of TI precipitated. When white kidney bean extract was treated by Millipore ultra-filtration system and a pilot-plant membrane separation device with retentive molecular 30 000 u, the retentive rates of α-AI activities were 98.32% and 84.63%, respectively, and the ones of TI activities were 27.20% and 20.77%, respectively. Consequently, ultra-filtration was helpful to realize the industrial separation of α-AI and TI from white kidney bean.

Key wordsα-amylase inhibitor; trypsin inhibitor; ultra high pressure; ultra-filtration

收稿日期：2015-11-20，改回日期：2015-12-04

基金项目：国家自然科学基金(31271977)；中央高校基本科研业务费专项资金(JUSRP 51501)资助

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604001

第一作者：硕士研究生(赵伟教授为通讯作者，E-mail：zhaow@jiangnan.edu.cn)。