胸腺嘧啶-15N2的合成与表征

2016-05-18 09:27:49徐建飞杜晓宁
同位素 2016年1期
关键词:甲酰中间体嘧啶

徐建飞,杜晓宁,王 伟,雷 雯,侯 捷

(上海化工研究院 同位素研究所,上海 200062)



胸腺嘧啶-15N2的合成与表征

徐建飞,杜晓宁,王伟,雷雯,侯捷

(上海化工研究院 同位素研究所,上海200062)

摘要:以甲酸乙酯和丙酸乙酯为原料,在金属钠存在下缩合得到中间体2-甲酰丙酸乙酯,中间体在酸催化下与同位素尿素-(15)N2缩合,在甲醇钠作用下环化反应得到胸腺嘧啶-(15)N2。合成方法操作简单,工艺流程短,副产物少,收率可达80%,(15)N同位素丰度稳定。产物经HPLC、IR、MS、1H NMR和(13)C NMR表征,结果表明:产物化学纯度>99%,(15)N同位素丰度>98 atom%。

关键词:同位素;胸腺嘧啶;2-甲酰丙酸乙酯

胸腺嘧啶又称5-甲基尿嘧啶,在药物合成中应用较广。胸腺嘧啶为DNA所需的4种基本碱基之一,具有一定的药理作用,可以合成抗癌药物胸腺嘧啶氮芥;与其他脱氧核糖核苷(如脱氧胞苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧腺苷)合用,能显著促进伤口愈合[1]。以胸腺嘧啶为中间体可以合成一系列抗病毒药物,如齐多夫定和司他夫定等[2-3]。

标记胸腺嘧啶及其核苷是研究脱氧核糖核酸(DNA)的生物合成、染色体的复制等生命活动的重要示踪剂[4]。应用标记胸腺嘧啶掺入法测定细菌生长速率是真实反映细菌活性和功能的重要手段,能真实反映细菌生理状态,并将此法应用于医学领域[5]、水生微生物学[6]、土壤科学等领域[7]。标记胸腺嘧啶掺入法测T淋巴细胞增殖反应,是目前国内外测定机体细胞免疫功能水平的重要指标,广泛应用于实验与临床免疫的研究工作[8]。

文献报道的胸腺嘧啶合成路线主要有以下4种。(1) 以α-甲基氰乙酸为原料,在醋酐溶液中与尿素缩合,再经铂或钯催化加氢环合得到胸腺嘧啶[9]。(2) 以丙酸乙酯、甲酸乙酯、硫脲、双氧水等为原料,经缩合、环合、氧化及中和4步反应,合成胸腺嘧啶产品,反应总收率达64.5%[10]。(3) 以丙酸乙酯、氯甲酸乙酯、苯甲酰氯等为原料,经缩合、氯化、氧化、酸化和环合5步反应,制备得到胸腺嘧啶[11]。(4) 以α-甲基丙烯酸为原料,经溴化和酰氯化制得中间体2,3-二溴-2-甲基-丙酰氯,中间体再与尿素缩合,然后在甲醇钠的作用下环合得到胸腺嘧啶。以上各种方法均存在合成路线较长,操作不便等缺点,且部分方法中较难以引入同位素标记原料,造成目标产物胸腺嘧啶-15N2的合成困难。综合以上方法,本研究拟以甲酸乙酯和丙酸乙酯为原料,在金属钠存在下缩合得到中间体2-甲酰丙酸乙酯,中间体在酸催化下与同位素尿素-15N2缩合,再在甲醇钠作用下环化反应得到胸腺嘧啶-15N2。

1实验部分

1.1主要仪器与装置

7890B-7000C气质联用仪:美国安捷伦公司,配有EI离子源及Qualitative Analysis B.06.00色谱工作站;LC-MS 2020液质联用仪:日本岛津公司产品,配有电喷雾离子源(ESI)及Lab Solutions系统工作站;Magna-IR-550型红外光谱仪:美国Nicolet产品,KBr压片制样;Bruker AV 400 MHz核磁共振:德国Bruker产品,配有超屏蔽超导磁体系统。

1.2主要材料与试剂

尿素-15N2:99.2 atom%15N,上海化工研究院研制;丙酸乙酯、甲酸乙酯:分析纯,美国Sigma-Aldrich公司产品;胸腺嘧啶:标准品,美国AccuStandard公司产品;其余均为市售的国产分析纯试剂。

1.3合成方法

胸腺嘧啶-15N2合成路线如图1所示。

250 mL三口圆底烧瓶中加入溶剂无水乙醚,混合0.3 mol甲酸乙酯和0.2 mol丙酸乙酯。搅拌中加入0.2 mol金属钠,水浴10 ℃反应,N2保护。反应液逐渐变浑浊,颜色由乳白色变成微黄色,最终成橙黄色,反应时间为24 h。反应结束后,加水搅拌,用10 mol/L硫酸调节pH=5,用乙醚萃取,饱和氯化钠水洗,无水硫酸钠干燥,旋干后得到橙黄色透明液体2-甲酰丙酸乙酯[11-12]。

将50 mmol尿素-15N2和50 mL甲醇混合,加入40 mmol 2-甲酰丙酸乙酯和3 g浓盐酸于三口烧瓶中,60 ℃搅拌反应。回流5 h后加入6 g甲醇钠至反应液中,继续60 ℃搅拌反应,反应4 h左右。用稀硫酸调节pH=5,结晶得到固体为黄色,加水溶解,活性炭脱色,冷却结晶得无色固体胸腺嘧啶-15N2,收率为80%(以尿素-15N2计)。

图1 胸腺嘧啶-15N2的合成路线Fig.1 Synthesis of thymine-15N2

2结果与讨论

2.1合成条件

考虑到合成反应中影响因素较多,拟采用正交实验法,对反应机理和单因素反应实验进行研究,确定3个影响因素分别为:反应温度(A)、反应时间(B)、尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩尔比(C),并以产物的收率作为考核指标,因素与水平的选择列于表1,正交实验结果列于表2,方差分析列于表3。

由表2可以看出,各因素对胸腺嘧啶收率的影响次序由大到小为:尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩尔比(C)>反应时间(B)>反应温度(A)。由表3可知,尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩尔比(C)对胸腺嘧啶收率有极显著的影响,而其他2个因素对胸腺嘧啶收率的影响则有限。由正交实验结果可知,反应的最优化条件是A3B2C2,即反应温度为60 ℃,反应时间为5 h,尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩尔比1.2∶1。最优条件二次验证实验平均结果胸腺嘧啶收率为81%,与正交实验的结论吻合。

表1 正交实验的因素与水平

表2 L9(33)的正交实验

表3 方差分析

2.2结构表征

2-甲酰丙酸乙酯:橙黄色液体,收率为95.8%。GC-MS:tR=5.3 min时,主峰为中间体2-甲酰丙酸乙酯(见图2);主峰EI-MSm/z:C6H10O3130.2[M],102.2[M-C2H5+H],85.2[M-C2H5-CH3+H],56.2[M-C2H5-CH3-CHO+H],分子离子峰与碎片峰与理论值相符(见图3)。

胸腺嘧啶-15N2:无色固体,HPLC经外标法定量计算化学纯度为99.1%(见图4)。1H NMR (DMSO-D6,400 MHz) ,δ:1.75[s,3 H,CH3],7.27 (s,1 H,CH);13C NMR(DMSO-D6),δ:11.72,107.66,137.63,151.46,164.87;ESI-MSm/z:129[M+H]+(见图5),经计算15N同位素丰度为98.5%。

图2 2-甲酰丙酸乙酯的GC谱图Fig.2 GC of ethyl 2-formylpropionate

图3 2-甲酰丙酸乙酯的EI-MS谱图Fig.3 EI-MS of ethyl 2-formylpropionate

图4 胸腺嘧啶-15N2的HPLC谱图Fig.4 HPLC of thymine-15N2

在红外谱图(见图6)中,IR(KBr),ν/cm-1: 3 199,3 062,2 927,1 729,1 677,1 440,1 207;解析为3 199、3 062 cm-1处为N-H的伸缩振动峰,在2 927 cm-1处为CH3的吸收特征峰,在1 927 cm-1处为CO伸缩振动峰,1 677、1 440 cm-1处为N-H的弯曲振动峰,1 201 cm-1处为C-H的弯曲振动峰。

图5 胸腺嘧啶-15N2的MS谱图Fig.5 MS of thymine-15N2

图6 胸腺嘧啶-15N2的IR谱图Fig.6 IR of thymine-15N2

3结论

以甲酸乙酯和丙酸乙酯为原料经两步反应合成胸腺嘧啶-15N2,并用HPLC、IR、MS、1H NMR和13C NMR对最终产物进行表征,确定其结构、化学纯度和同位素丰度。该方法制备目标产物路线简洁、高效,得到的化合物为进一步研究同位素标记嘧啶衍生物提供参考。

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Synthesis and Characterization of Thymine-15N2

XU Jian-fei, DU Xiao-ning, WANG Wei, LEI Wen, HOU Jie

(ResearchInstituteofIsotope,ShanghaiResearchInstituteofChemicalIndustry,Shanghai200062,China)

Abstract:A novel and mild synthesis method of thymine-(15)N2 was designed. Ethyl formate and ethyl propionate as raw materials, the intermediate ethyl 2-formylpropionate was condensed under sodium metal, the target compound thymine-(15)N2 was obtained by condensation with isotope urea -(15)N2 under acid catalysis. Synthesis route had the advantages of simple operation, short process flow and less side product. The yield was more than 80% and isotope (15)N abundance did not diluted. The product was characterized by HPLC, IR, MS,1H NMR and (13)C NMR. The chemical purity was more than 99% and (15)N enrichment was more than 98 atom%.

Key words:isotope; thymine; ethyl 2-formylpropionate

doi:10.7538/tws.2016.29.01.0053

中图分类号:TL92+3

文献标志码:A

文章编号:1000-7512(2016)01-0053-05

作者简介:徐建飞(1979—),男,上海人,高级工程师,主要从事同位素标记化合物的合成研究

基金项目:国家科技部科技支撑计划专项(2015BAK45B01);上海市科委地方攻关计划课题(14DZ0511800)

收稿日期:2015-08-13;修回日期:2015-09-17

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