布洛芬对偏头痛大鼠模型三叉神经节神经元电压门控型钙通道的影响

陆燕，何清，刘沙

布洛芬对偏头痛大鼠模型三叉神经节神经元电压门控型钙通道的影响

陆燕1，何清1，刘沙2

目的：探讨布洛芬对偏头痛大鼠模型三叉神经节神经元高电压激活钙通道电流（HVA-ICa）的调控作用。方法：雄性SD大鼠24只随机分为3组：生理盐水（NS）组、致炎剂（IS）+降钙素基因相关肽（CGRP）（IS+ CGRP）组和布洛芬组，各8只。采用新型IS构建偏头痛大鼠模型，全细胞式膜片钳技术记录急性分离的三叉神经节神经元钙电流（HVA-ICa）。结果：与NS组相比较，（IS+CGRP）组HVA-ICa峰值密度增高，激活电压向超级化方向移动（P＜0.05）；与（IS+CGRP）组相比，布洛芬组钙电流峰电流降低（P＜0.05）。与NS组相比，（IS+CGRP）组半数激活电压向超级化方向移动（P＜0.05）；与（IS+CGRP）组相比，布洛芬组半数激活电压向去级化方向移动（P＜0.05）。与NS组相比，（IS+CGRP）组半数失活电压向去级化方向移动（P＜0.05）；与（IS+CGRP）组相比，布洛芬组半数失活电压向超级化方向移动（P＜0.05）。结论：布洛芬能够降低三叉神经节神经元HVA-ICa的幅度、促进HVA-ICa的失活。

偏头痛；三叉神经节；钙通道；布洛芬

偏头痛是一种常见的反复发作性的脑功能异常疾病，表现为单侧或双侧的搏动性头痛，可伴有畏光或畏声等先兆症状，一般持续3～72 h，休息可缓解头痛的发作[1]。目前，偏头痛的发病机制尚未明确，主要包括两大学说：皮质扩散性抑制学说（cortical spreading depress，CSD）和三叉神经血管学说[2]。既往研究提示：先兆的发生和CSD有关，而偏头痛的发作是三叉神经血管系统（trigeminovascular system，TGVS）激活所导致[2]。TGVS被激活后，P物质（substance P，SP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）和神经肽A（neurokinin A，NKA）等神经递质从三叉神经末梢中释放，造成硬脑膜血管扩张、血管内血浆外渗、血小板激活以及肥大细胞脱颗粒，诱发脑膜神经源性炎症反应，导致头痛的发作[3]。

电压门控型钙离子通道（voltage-gated calcium channel，VGCC）在神经递质释放以及超极化的复极化过程起重要作用，其特性改变影响神经元的兴奋性和活性[4]。在TGVS中，VGCC通过调节中小三叉神经节神经元上Aδ纤维和C纤维的兴奋性，影响神经末梢CGRP的释放，同时参与疼痛信号的传递[5]。Xiao等[6]发现三叉神经节神经元上的VGCC参与调节高KCl诱导的CGRP释放，而钙通道阻滞剂能抑制该现象发生。非甾体类抗炎药布洛芬（Ibuprofen）主要通过抑制中枢及外周神经系统中前列腺素E的合成来发挥镇痛作用，在偏头痛急性期广泛应用[7,8]。

本实验采用新型复方化学致炎剂（inflammatory soup，IS）+CGRP刺激大鼠硬脑膜，成功构建偏头痛大鼠模型。通过观察硬脑膜神经末梢敏化对三叉神经节神经元细胞上高电压激活钙通道电流（high voltage activated calcium current，HVA-ICa）的影响，以及布洛芬对偏头痛大鼠模型中HVA-ICa的作用，初步探讨布洛芬对VGCC的调控作用，为研究布洛芬缓解偏头痛发作的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠24只，体质量250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。饲养于徐州医学院实验动物中心，室温21℃～25℃，相对湿度约50%，12 h白天/黑夜循环控制。

1.1.2 主要试剂与材料 NaCl、MgCl2、CaCl2、D-glucose、NaOH、KCl、KH2PO4、NaHCO3、Na2HPO4、布洛芬、CsF、EGTA、谷氨酰胺、HEPES、Na-ATP、TEA-Cl、胶原酶I型、Mg-ATP、Li-GTP、CsOH、胰酶、5-羟色胺、组胺、缓激肽、前列腺素E2均购自美国Sigma公司；10%水合氯醛、羟乙基哌嗪乙磺酸为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组、偏头痛大鼠模型的建立及硬脑膜给药 按照随机法将大鼠分为生理盐水（normal saline，NS）组、（IS+CGRP）组、布洛芬组，各8只。10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，立体定位仪固定头部，暴露颅骨。定位于后囟点，钻开颅骨，充分暴露上矢状窦（superior sagittal sinus，SSS）。将PE-10软管置入SSS，并完全固定。术后第4天通过PE-10软管给予药物。NS组给予20 μL NS；（IS+CGRP）组给予10 μL IS（包含 2 mmol/L 5-羟色胺、缓激肽、组胺和0.2 mmol/L前列腺素E2）+10 μLCGRP（10-4mol/L）[9,10]；布洛芬组先给予布洛芬混悬液（27 mg/kg）灌胃，1 h后通过PE-10软管给予10 μL IS+10 μL CGRP。

1.2.2 三叉神经节神经元急性分离 各组大鼠给药1 h后，断头去除脑组织，将颅底一对三叉神经节取出置于Hank’s平衡溶液中洗净，转入含有1.5 mg/mL胰酶和0.5 mg/mLI型胶原酶中，37℃水浴消化15～20 min，标准外液洗3遍，巴斯德管吹打至神经节分散，200目滤网过滤并转移至35 mm培养皿中，放置于孵箱，贴壁6 h后进行全细胞膜片钳实验。

1.2.3 全细胞膜片钳记录 选用细胞膜清晰、轴突完整的中小三叉神经节神经元进行实验。EPC-10膜片钳放大器记录，pulse+pulsefit程序（德国HEKA公司）进行电流的记录。电极入液后，与细胞形成高阻抗封接（＞1 GΩ），负压破膜，同时补偿慢电容（Cs）和局部串联电阻（Rs）。将Rs＜20 MΩ并且电流稳定的数据视作有效。钳制电压为-60 mV，指令电压为-50 mV～+30 mV，10 mV递增，激活阈值为-40 mV，峰值电压0 mV，并且可以被100 μmmol/L CdCl2完全阻断，提示记录到HVA-ICa电流，见图1。

图1 正常三叉神经节神经元高电压激活钙电流及I-V曲线

1.3 统计学处理

通过Clampfi软件（美国Axon公司）处理电流曲线。采用SPSS 19.0软件处理数据，计量资料以（±s）表示，配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 布洛芬对偏头痛大鼠三叉神经节神经元HVA-ICa的抑制作用

峰值电流的激活电压NS组为0 mV，（IS+CGRP）组向超级化方向移动-10 mV。NS组、（IS+CGRP）组及布洛芬组的HVA-ICa峰电流分别为（-50.3±4.28）、（-80.21±3.96）及（-54.84±5.82）pA/pF；（IS+CGRP）组高于NS组（P＜0.05），布洛芬组低于（IS+CGRP）组（P＜0.05），见图2。

图2 布洛芬对偏头痛大鼠三叉神经节神经元钙电流的抑制作用

2.2 布洛芬对偏头痛大鼠三叉神经节神经元HVA-ICa激活曲线的影响

NS组、（IS+CGRP）组及布洛芬组HVA-ICa的半数激活电压（Va1/2）分别为（-17.3±0.5）、（-21.5±0.4）及（-18.9±1.5）mV；（IS+CGRP）组激活曲线较NS组向超级化方向移动4.2 mV，差异有统计学意义（P＜0.05），布洛芬组激活曲线较（IS+CGRP）组向去级化方向移动2.4 mV，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

2.3 布洛芬对偏头痛大鼠三叉神经节神经元HVA-ICa失活曲线的影响

NS组、（IS+CGRP）组及布洛芬组HVA-ICa的半数失活电压（Vi1/2）分别为（-24.8±0.5）、（-13.6±0.4）及（-17.9±2.0）mV；（IS+CGRP）组失活曲线较NS组向去极化方向移动11.2 mV，差异有统计学意义（P＜0.05），布洛芬组失活曲线较（IS+CGRP）组向超级化方向移动了4.3 mV，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图3 布洛芬对偏头痛大鼠三叉神经节神经元钙电流激活曲线的影响

图4 布洛芬对偏头痛大鼠三叉神经节神经元钙电流失活曲线的影响

3 讨论

偏头痛发作时，硬脑膜血管扩张和神经源性炎症通过刺激硬脑膜及血管周围的痛觉感受器，造成三叉神经元兴奋，并将痛觉信号上传至大脑皮质，产生头痛；同时，三叉神经末梢释放神经源性递质，如SP、CGRP和NKA等[11]。疼痛敏感组织受到刺激，Tenascin-C（TNC）细胞兴奋和激活，再次释放血管活性物质，造成脑膜的无菌性炎症反应，导致血管扩张，延长头痛的发作时间，增加头痛的程度[12]。偏头痛发作时，CGRP被释放至颈内和颈外的静脉血[13]。在无先兆偏头痛患者的外周血中能检测到CGRP水平增高；给予偏头痛发作期患者舒马普曲坦治疗后，颈静脉血CGRP水平降至正常[13,14]。外源性给予患者CGRP，同样可诱发偏头痛样症状发作。CGRP可引起脑膜动脉扩张，促使肥大细胞脱颗粒、释放组胺，从而参与神经源性炎症反应[15,16]。感觉神经末梢激活后，CGRP和SP释放，刺激脑膜伤害感受器，通过正反馈调节作用，延长头痛发作的时间[16,17]。肥大细胞脱颗粒能激活硬脑膜上的C纤维和Aδ纤维，并激活三叉神经脊束核，将疼痛信号向丘脑和皮质传递[18]。IS是多种化学炎性刺激物的混合物。向大鼠延髓池注入IS能引起TGVS激活，促进CGRP释放，同时还造成大鼠前爪皮下肥大细胞脱颗粒，降低大鼠的痛觉阈值[9,19]。硬脑膜伤害感受器反复激活会造成中枢和外周神经系统功能和形态的改变，使痛觉阈值降低，产生痛觉敏化。在大鼠硬脑膜处放置PE-10管，清醒状态下给予IS，造成TGVS的反复激活，能较为完善地模拟三叉神经血管反射学说的病理生理过程。

VGCC的激活与神经递质的释放及神经元兴奋性有密切关联[20]。阻滞电压门控型钙通道可显著减少神经末梢CGRP的释放[21,22]。培养三叉神经节神经元，发现CGRP表达量与VGCC的表达量呈正相关；与其他细胞相比，CGRP和VGCC有共表达的神经元，其轴突数量和密度也增加[23]。本实验发现：与NS组相比较，IS+CGRP组HVA-ICa峰电流密度增高，并具有电压依赖性；IS+CGRP组的HVA-ICa激活曲线向超级化方向移动，提示VGCC对电压改变的敏感性增强，细胞膜兴奋性增高，通道容易激活；同时IS+CGRP组HVA-ICa的失活曲线向去极化方向移动，提示在外周敏化条件下，VGCC的失活阈值增高，不易失活。

布洛芬为选择性的COX-2抑制剂，通过抑制前列腺素和其他神经炎性介质合成，减轻局部组织炎症反应，降低局部神经的痛觉敏感性，发挥镇痛作用[24,25]。在本实验中，与IS+CGRP组相比较，布洛芬能抑制硬脑膜传入神经末梢激活导致的HVA-ICa增高，并且具有电压依赖性；布洛芬组的HVA-ICa激活曲线向去极化方向移动，提示VGCC对电压改变的敏感性降低，不易被激活，细胞膜兴奋性降低；同时布洛芬组的HVAICa失活曲线向超级化方向移动，提示布洛芬抑制VGCC的活性，并与失活的VGCC结合，使VGCC长期处于稳态失活状态。布洛芬对VGCC的这种调控，使静息条件下对去极化产生反应的VGCC数量减少，三叉神经节神经元对外界刺激的敏感性降低，三叉神经节神经元兴奋性降低，痛觉信号的传递受到抑制；同时布洛芬通过抑制三叉神经节上VGCC的开放，减少突触后膜神经炎性递质的释放，减轻神经源性炎症反应，缓解偏头痛的发作。

综上所述，本实验通过新型的IS构建大鼠偏头痛模型，对三叉神经节神经元的外周敏化过程进行研究，为探讨VGCC在偏头痛信号传递过程中的作用提供了相关实验依据。

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（本文编辑：王晶）

Effects of Ibuprofen on High Voltage Active Calcium Currents in Trigeminal Ganglion Neu-rons in Rat Model of Migraine

LU Yan1,HE Qing1,LIU Sha2.
1.Department of Neurology,the First People's Hospital of Xuzhou,Jiangsu 221000,China;2.Department of Neurology,Affiliated Hospital,Xuzhou Medical University,Jiangsu 221002,China

Objective:To investigate the effects of ibuprofen on high voltage active calcium currents(HVAICa)in trigeminal ganglion neurons in rat model of migraine.Methods:Twenty-four male adult SD rats were randomly divided into 3 groups(n=8 respectively):normal saline treatment(NS)group,IS+CGRP group and ibuprofen group.The migraine models were established by IS+CGRP,and changes of HVA-ICa of trigeminal ganglion neurons were recorded using whole-cell patch clamp technique.Results:The peak amplitude of HVA-ICa in (IS+CGRP)group was increased compared to NS group,and activation voltage was shifted to hyperpolarization (P＜0.05).Ibuprofen inhibited the peak amplitude of HVA-ICa compared to(IS+CGRP)group(P＜0.05).The half-activation voltage(Va1/2)in(IS+CGRP)group was shifted in the hyperpolarizing direction compared to NS group(P＜0.05),and ibuprofen shifted Va1/2 in the depolarizing direction compared to(IS+CGRP)group(P＜0.05).The steady-state inactivation curve in(IS+CGRP)group was shifted towards more depolarizing potentials compared to NS group(P＜0.05),and ibuprofen shifted the half-inactivation voltage(Vi1/2)in the hyperpolarizing direction compared to(IS+CGRP)group(P＜0.05).Conclusion:Ibuprofen can reduce the amplitude of HVA-ICa of trigeminal ganglion neurons,and promote the inactivation of HVA-ICa.

migraine;trigeminal ganglion;calcium channels;ibuprofen

R741;R741.05

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.002

1.徐州市第一人民医院神经内3科

江苏 徐州 221000 2.徐州医科大学附属医院神经内1科江苏 徐州 221002

2015-09-04

刘沙

lululiusha@163. com